花生中UDP-glucosyltransferase基因的克隆及在非生物胁迫下的表达研究

通过RACE技术从花生叶片cDNA中克隆到了UDP-glucosyltransferase基因,命名为AhUGT83A1-like （Genbank注册号为KF411463）。该基因全长为1 530bp,ORF为1 380bp,编码460个氨基酸。序列比对与进化分析结果表明,该序列有保守的UDPGT结构域,并且与其它植物的UGT蛋白同源性较高。荧光定量PCR结果表明,AhUGT83A1-like基因在高盐和低温处理的花生根和叶片中均上调表达;在干旱处理时,根中表达也受到显著上调,但叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhUGT83A1-like可能参与了花生对干旱、低温和高盐的抗性调控。ABA处理结果表明,AhUGT83A1-like在花生根中对ABA响应明显,但在叶片中对ABA没有明显响应,表明该基因在花生根中对非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式发挥作用的。?     

花生中蔗糖合成酶基因AhSuSy在花生中的组织表达及对非生物胁迫响应研究

低温、高盐和干旱胁迫严重影响植物的生长和产量。本研究以花生品种花育33号为实验材料,根据cDNA文库中已知的蔗糖合成酶基因AhSuSy全长序列设计引物,通过RT—PCR克隆到该基因。通过荧光定量PCR分析了该基因在花生各组织中的表达及在低温、高盐等非生物胁迫下的表达。结果显示,该基因为组成型表达基因,在叶片和根中表达量较高,在花中表达量最低;AhSuSy基因在花生的叶片和根中对低温均没有明显响应,但在花生根中受高盐胁迫和干旱胁迫明显诱导,说明该基因可能参与了花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控;AhSuSy在花生根中受ABA的明显诱导,说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。     

花生DREB类转录因子基因AhDREB3的序列及非生物胁迫下表达分析

DREB类蛋白属于AP2/ERF转录因子家族的一个亚家族,在植物非生物胁迫抗性调控中具有重要功能。为了挖掘花生逆境胁迫相关功能基因AhDREB3,从已公布的花生基因中找到干旱应答元件结合蛋白3（AhDREB3）的编码基因全序列,做编码蛋白的进化分析。根据已知序列设计引物,通过荧光定量PCR检测了该基因在低温、高盐和干旱胁迫下及对外源ABA响应和表达。荧光定量PCR结果显示,AhDREB3基因在花生的叶片和根中对低温没有响应,对高盐（叶片和根）和干旱（根）胁迫有较大响应,说明它可能参与了花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控。此外,AhDREB3基因的表达在花生叶片和根中对外源ABA响应变化小,暗示了该基因在花生中可能通过不依赖于ABA的方式起作用。     

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。     

花生MAPK13基因的克隆及表达分析研究

为了挖掘花生抗果腐病相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,从花生果腐病转录组文库中筛选出促丝裂原活化蛋白激酶13(MAPK13)基因编码区序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMAPK 13基因°结果表明AhMAPK 13基因序列全长1818 bp,含有/非编码区593 bp,5非编码区122 bp,开放阅读框全长1104 bp,编码1条含有368个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为42. 5kDa,含有MAPK家族典型的11个结构域,属于MAPK基因家族B组成员。亚细胞定位显示AhMAPK13定位于细胞质和细胞核中° RT-qPCR分析发现AhMAPK 13基因在茎中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMAPK 13基因受干旱、低温、NaCl(ABA诱导时表达量上升,说明该基因可能广泛参与植物非生物胁迫响应过程;AhMAPK 13基因受JA、GA、ET、SA诱导时表达量上调,说明该基因可能参与到这些激素介导的抗逆信号转导途径。本研究结果为花生抗果腐病育种研究提供了新的基因资源。     

水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的克隆及表达分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是生物体内信号转导的重要组分,受多种生物及非生物胁迫的刺激活化。利用RT-PCR方法克隆了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK14的cDNA序列(GenBank登录号为GQ265780)。该序列全长1660bp,包含1个1629bp的开放阅读框,编码蛋白由542个氨基酸组成,包含典型的蛋白激酶结构域及磷酸化位点TDY基序。序列比对和分析显示,OsMPK14基因位于水稻第5染色体上,其编码区由9个外显子和8个内含子组成。采用半定量RT-PCR技术,检测了光照、低温、高盐、干旱和脱落酸对该基因在水稻地上部分和根中表达的影响。结果显示高盐、低温、脱落酸都能上调其表达,而干旱对其表达具有微弱的抑制效应,光照可以降低该基因在水稻地上部分的表达,提高在根中的表达。基因可能在水稻非生物胁迫的应答中具有重要作用,其表达受多种因素调控。     

花生中促丝裂原蛋白活化激酶6a(AhMAPK6a)的克隆与表达分析

促丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)是一类保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,是一类植物对逆境胁迫反应途径中的关键家族基因。本研究利用已经构建的花生种子全长cDNA文库,以拟南芥MAPK序列为模板,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了一个MAPK基因,命名为AhMAPK6a,并在GenBank上注册,注册号为KP329549。其cDNA序列全长1492bp,开放阅读框(ORF)含有1191bp,编码一条含有397个氨基酸的蛋白序列。不同物种中MAPK基因的氨基酸序列比对发现,该基因含有典型的Ser/Thr保守基序,与拟南芥、大豆、本生烟的同源性分别为86%、94%和90%。不同组织部位的荧光定量(qPCR)分析表明,该基因在叶片中的表达量最高,其次在根中,在茎、花、子叶和下胚轴中的表达量极低,表明该基因可能在花生的根和叶的生长发育中发挥较大作用。在脱落酸(ABA)和聚乙二醇(PEG)胁迫下,表达量发生明显变化,可以推测该基因在干旱胁迫反应中发挥重要作用。     

海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因SpLea5的克隆与表达分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术从海马齿根中分离获得了一个海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因的全长cDNA,命名为SpLea5。序列分析结果表明,SpLea5基因cDNA全长685 bp,含有一个294 bp的完整开放阅读框,编码97个氨基酸残基;推测编码的氨基酸序列与柽柳、杨木樨、烟草、甜橙、温州蜜柑、麻风树和陆地棉中相应基因的氨基酸序列一致性为54%、52%、48%、47%、47%、46%、44%、41%,在聚类分析时与高等植物聚为一类。SpLea5在海马齿植株中呈组成型表达,但根中表达最为丰富,茎和叶次之;海水、NaCl、PEG、ABA处理均能够诱导根部SpLea5基因的表达。这些结果表明,SpLea5基因可能参与了海马齿对盐和干旱胁迫的分子响应。     

小麦TaPK7基因的克隆及其在多种胁迫条件下的表达分析

为了揭示小麦TaPK7基因对不同逆境胁迫的应答机制, 以SAPK7基因的全长cDNA序列为信息探针,采用电子克隆和RT-PCR的方法,从抗旱小麦品种旱选10号中克隆到一个包含1 074 bp开放阅读框、编码357个氨基酸的cDNA序列,命名为TaPK7.生物信息学分析表明,TaPK7同时具有磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的活性.氨基酸序列比对发现,TaPK7与水稻、玉米、大麦等植物中受逆境胁迫诱导表达的直系同源基因高度同源.实时定量RT-PCR检测结果表明,TaPK7参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫和ABA处理的应答反应,但在不同胁迫或处理下的表达模式不同,TaPK7对四种非生物胁迫的敏感性次序为:高盐＞高渗＞低温＞ABA.     

披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鉴定

为了从抗逆性优良的牧草中挖掘新的耐盐、抗旱基因,进而为作物分子育种提供优良的基因资源,采用RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)方法,克隆了披碱草的焦磷酸化酶基因EdHP1,其全长序列包含2310bp,编码770个氨基酸,含有14个跨膜区,是一个典型的膜蛋白,同时包舍三个保守区(CS1、CS2和CS3).氨基酸同源性比较发现,EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶基因的同源性大于86%.EdHP1基因的表达受干旱、高盐和低温等非生物胁迫的诱导.功能分析证明,EdHP1基因能够显著提高转基因烟草对干旱、高盐胁迫的抗性,可用于作物的抗逆遗传改良.     

小麦LEAsm基因及其启动子的克隆与功能研究

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一个小的高亲水性的蛋白家族,该蛋白家族在逆境胁迫下大量积累,保护植物免受逆境胁迫。LEA蛋白可分为7组,其中重复的11-氨基酸基序是第3组LEA蛋白的特征。为深入分析第3组LEA蛋白在小麦响应逆境胁迫中的作用机制,利用芯片技术从小麦表达谱中筛选出一个渗透胁迫诱导表达的第3组LEA蛋白基因TaLEAsm,然后根据该基因序列设计引物筛选石麦15的BAC文库,获得1个含有该基因的BAC单克隆,以该BAC单克隆质粒为模板,通过BAC延伸测序克隆了TaLEAsm基因及其启动子序列,并对TaLEAsm序列特征、表达模式和启动子功能进行了初步分析。结果表明,TaLEAsm基因序列仅含有1个105bp的内含子,其开放读码框长675bp,编码224个氨基酸。TaLEAsm含有10个11-氨基酸重复序列,属于第3组LEA蛋白。低温、高盐和渗透胁迫均诱导TaLEAsm基因上调表达,但在根和叶中表达模式不同。在TaLEAsm基因起始密码子上游1 500bp序列中,预测含有14个逆境响应顺式元件。在拟南芥中,TaLEAsm基因启动子能够启动GUS基因表达,渗透胁迫诱导GUS基因明显上调表达。以上结果表明,TaLEAsm为小麦脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫诱导启动子。     

大豆GmNCED1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1 836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84%以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

玉米蜕皮激素合成酶基因ZmCYP92A1的克隆和表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从玉米中克隆ZmCYP92A1,GenBank登录号为KY270496.1。该基因全长1 713 bp,开放阅读框为1 551 bp,编码517个氨基酸。预测ZmCYP92A1蛋白分子量为58.58 kD,理论等电点为6.44,存在2个跨膜结构域,1个信号肽,有1个P450保守结构域。多序列比对表明,ZmCYP92A1蛋白与其他物种的CYP92A1蛋白具有极高的相似性。系统发生分析揭示,CYP92A1蛋白与属于CYP75亚家族的类黄酮3-单加氧酶的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果发现,非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)均诱导ZmCYP92A1基因的表达,表明该基因参与植物抵御非生物胁迫。     

野生大豆胁迫应答LRR类受体蛋白激酶基因的克隆及其表达特性分析

从前期构建的野生大豆在高盐、低温、干旱早期的基因表达谱中,选取了在4℃胁迫早期(1 h)上调表达的LRR-RLK的EST,通过SMART和RACE结合的方法获得了GsLRPK的全长序列:该基因全长2 264 bp,共编码714个氨基酸。生物信息学分析表明其氮端含有1个LRR N-terminal domain及串联排列的LRR-Motif;碳端含有丝/苏氨酸蛋白激酶催化结构域的11个亚基。此外,GsLRPK蛋白氮端22个氨基酸为可能的信号肽序列,并且存在1个跨膜结构域,很可能定位于细胞质膜或细胞器膜。半定量PCR分析显示该基因可受干旱、ABA、4℃低温及高盐胁迫的诱导,可能作为一个"关键节点"在胁迫信号传导通路中发挥重要作用。     

苦瓜McAPX2基因及其启动子的克隆与表达分析

基于苦瓜叶片均一化文库克隆得到McAPX2基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KJ722767.1),采用染色体步移法获得该基因的启动子序列,实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同器官中的表达量及低温胁迫对McAPX2表达量的影响。结果表明:McAPX2基因全长1 086 bp,开放阅读框747 bp,编码249个氨基酸;McAPX2属于过氧化物酶家族ClassⅠ的成员,其脂肪族氨基酸指数为83.90,是一个亲水性蛋白,可推测定位于细胞质中;与甜瓜(NP_001284378.1)、黄瓜(ACO90193.1)、南瓜(AHF27424.1)、苦瓜(AGJ72851.1)同源性较高,分别为95%,94%,94%和93%;q RT-PCR结果显示,在苦瓜的根、茎、叶、雌花和幼果等组织器官中McAPX2的表达量存在显著差异,其中根的表达量最大,而在叶片中的表达量最低;在低温胁迫下,随着胁迫时间的延长,McAPX2表达量逐渐上调,处理12 h时达到最大,随后下降,说明该基因的表达与苦瓜耐低温胁迫相关。分离得到McAPX2基因上游调控序列1 267 bp,其启动子含有与GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物胁迫以及热激、干旱、低温、光等非生物胁迫的相关元件。     

甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因的克隆与表达分析

以水稻ABA99594序列为探针, 使用电子克隆技术, 获得甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因（Diaminopimelate epimerase, DAPE）的1条cDNA全长序列,命名为ScDAPE。经RT-PCR扩增和序列分析验证后, 该基因序列与电子克隆结果一致, 基因全长1 168 bp, 包含1个816 bp的开放阅读框, 编码271个氨基酸残基, 生物信息学分析预测该基因编码蛋白定位于内质网膜, 为可溶性酸性蛋白, 无信号肽, 二级结构元件多为无规卷曲, 含有2个保守功能域, 主要功能为氨基酸合成。电子表达分析结果显示, 该基因在甘蔗侧芽、 花序、 叶片和顶端分生组织中均有表达, 花序中的表达量最高, 且该基因的表达受温度调控。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗根、 蔗髓、 蔗皮、 侧芽、 叶片、 叶鞘中均有表达, 且在根中的表达量最高。此外, 该基因的表达受水杨酸（salicylic acid, SA）、 脱落酸（abscisic acid, ABA）、 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）、 模拟干旱（PEG）、 高盐（NaCl）和氯化镉（cadmium chloride, CdCl2）的胁迫诱导, 其中受水杨酸胁迫后表达量最高, 约为对照组的12.4倍, 其次为聚乙二醇, 约为对照组的2.72倍, 推测该基因的表达与甘蔗抗病性和抗渗透胁迫有关。研究结果为甘蔗中不同DAPE基因的克隆和功能验证以及甘蔗ScDAPE基因在甘蔗基因工程中的应用奠定了一定的基础。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

橡胶树HbWRKY3的克隆及其响应逆境胁迫的表达分析

通过RACE技术扩增获得橡胶树HbWRKY3基因,并对该基因及其所编码氨基酸序列进行生物信息学分析和响应逆境胁迫的表达分析,结果表明：该基因含有2个WRKYGQK结构域和2个C2H2锌指结构,属于WRKY基因家族第Ⅰ类;由4个外显子和3个内含子组成,DNA序列全长3 780 bp;开放阅读框长度为2 211 bp,编码由737个氨基酸组成的多肽。该基因定位于细胞核中,在橡胶树叶片、树皮、花、胶乳等不同组织中都有表达,以花中的表达水平最高。盐、PEG、茉莉酸、水杨酸等非生物胁迫均可诱导HbWRKY3的表达,但干旱、ABA、乙烯和低温胁迫的诱导较为明显。     

花生酰基载体蛋白硫酯酶(FATB2)基因的克隆与表达分析

本研究从花生中分离得到1个FATB基因,命名为AhFATB2,其全长为1245bp,编码414个氨基酸,属于亲水性蛋白。利用荧光定量PCR分析了该基因在不同组织、种子不同发育时期、多种非生物逆境胁迫和激素处理下的表达情况。结果显示,AhFATB2基因在花中表达量最高,并且在种子发育过程中表达量逐渐升高。在非生物胁迫和激素处理下,AhFATB2基因的表达量均有不同程度的上调,推测该基因可能参与花生对逆境胁迫的适应性调控。该研究为将来改良花生品种提供了基因资源,同时揭示了AhFATB2基因在花生抗逆性中可能发挥的作用。     

巴西橡胶树HbRD22基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术从低温诱导的巴西橡胶树全长cDNA文库中获得了HbRD22基因,该基因全长1 458 bp。生物信息学分析结果表明,HbRD22编码一个由338个氨基酸组成的、相对分子量为36.96 ku、等电点为7.65的多肽,并含有一个由217个氨基酸组成的BURP结构域。其推导的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达69%。信号肽预测结果表明HbRD22蛋白为分泌型蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽区域。Northern blotting分析结果表明,该基因在正常生长情况下,表达水平较高,干旱胁迫后24 h,表达量逐渐减低,直至检测不到,揭示该基因受干旱胁迫负调控。