利用Cre-loxP自动去除禽痘病毒重组体的报告基因

在含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒侧翼各引入1个loxP序列。以禽痘病毒282E4株作为候选载体,通过同源重组将其插入到病毒基因组的FPV030区域,获得了表达GFP的重组禽痘病毒。然后在Cre酶介导下,利用loxP位点特异性重组剪除了重组病毒基因组中的GFP报告基因。结果表明,以GFP作为筛选标记使重组病毒的构建更为简便,同时利用Cre-loxP系统可以轻松地去除报告基因。这种技术有利于其它抗原性基因重组禽痘病毒的构建。     

筛选标记基因删除在柑橘中的研究进展

摘要: 选择标记基因是引发公众对转基因产品关注的首要因素,严重阻碍了转基因产品的商业化。基于位点特异性重组酶系统R/Rs和Cre/loxP无选择标记基因转化体系已被成功用于marker-free转基因柑橘的创制。在柑桔中,R/Rs重组酶系统介导的标记基因的删除往往不精确且有嵌合体;对于Cre/loxP重组酶系统,基于化学诱导系统构建的删除系统能有效清除marker 基因,但同样存在删除不完全的缺点。组成型表达启动子驱动Cre/loxP重组酶系统表现出极高的删除效率,且极少有嵌合体的发生。FLP/FRT重组酶系统已被成功用于转基因植物标记基因的删除,但在柑橘还没有相关的报道。     

诱导性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的构建及鉴定

通过PCR方法分别从pGL3-Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA;利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,并从pGcFRT2NeoR上用Xhol Ⅰ和Sal Ⅰ酶切得到FRT2NeoR盒子.将上述4个片段利用SOE-PCR及T5 DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体pET28a(+)构建Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR.用LipofeetamineTM2000介导转染猪成纤维细胞,G418筛选阳性细胞,PCR鉴定.结果表明,成功构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR,并成功整合到猪成纤维细胞的基因组中,获得了诱导性表达Cre重组酶的转基因猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得诱导性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础.     

肝特异性表达Cre重组酶转基因猪成纤维细胞的建立

试验旨在建立肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞系,为获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。通过PCR方法分别从血液和pcDNA3.1(+)载体上扩增肝脏特异性启动子α1-抗胰蛋白酶启动子(PhAAT)和BGHpolyA片段。通过双酶切(XhoⅠ、SalⅠ)从载体pGC-FRT2neo上获得FRT2neo交换盒,再利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,最后通过三重融合PCR方法和酶切方法将4个片段连接。利用真核表达载体pC1-neo构建出Cre表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo。Lipofectamine^TM2000介导转染猪成纤维细胞,通过G418筛选出阳性细胞系,最后通过PCR鉴定证明构建的Cre重组酶表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo成功整合到细胞的基因组中,获得了肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础。     

应用Cre-loxP系统构建伪狂犬病病毒gE/TK双缺失株

为了构建无报告基因的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE/TK双缺失株,以PRV-JSZ株为亲本毒株,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,先构建出带有loxP位点的rPRV-gE-/GFP,通过Cre重组酶处理后,获得剔除EGFP的gE单缺失株rPRV-gE ;再以rPRV-gE为母本,以相同方法构建gE/TK双缺失株rPRV-gE/TK.荧光检测和PCR结果显示成功构建了gE单缺失株和gE/TK双缺失株 ;病毒生长曲线测定可见rPRv-gE在PK15细胞上的增殖速度与野生株相似,而rPRV-gE/TK较为缓慢 ;rPRV-gE/TK对小鼠的半数致死量大于1×105 TCID50,显著高于rPRV-gE和野生株 ;缺失株免疫小鼠强毒攻击后能提供80％的保护.这些结果表明以Cre/loxP系统可重复使用构建伪狂犬病病毒多基因缺失株,为研制伪狂犬病病毒基因缺失苗和载体疫苗提供了快速筛选的技术平台.     

腔上囊病病毒VP2基因重组腺病毒的构建

采用RT～PCR方法扩增腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因，亚克隆到pAdlox转移载体，与野生型腺病毒φ5一起共转染Cre8细胞，将IBDVVP2基因在5型腺病毒中进行表达。结果，获得了含有腔上囊病病毒VP2基因的重组腺病毒Adv—VP2，感染重组腺病毒的细胞经Westernblotting检测，得到了1个约37ku的VP2多肽，而感染空载体病毒的细胞及对照细胞则无此蛋白条带。证实，成功构建了表达IBDVVP2基因的重组腺病毒。     

传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒（ILTV）糖蛋白gB基因，通过EcoRI位点克隆至杆状态病毒转移载体pVL1393中，构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB，将rpVLgB转移载体质粒与杆状态病毒DNA（Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞，经3轮蚀斑纯化，获得重组病毒并命名为rpVL－ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中，直接免疫荧光试验和Dot－ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞保获得表达，表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗，该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的HA和NA基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建重组鸡痘病毒(rFPV—HA—NA)，经体外、体内试验表明该重组鸡痘病毒具有良好的免疫原性。同时经细胞连续传代，证实了重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性，从而进一步保证了该疫苗的免疫原性。     

鸡马立克氏病基因工程二价苗重组病毒分子生物学特性鉴定

用磷酸钙沉淀法将MD Ⅰ型病毒gB基因插入到HVT病毒载体中制成MD重组病毒DNA，再将重组DNA转染于鸡胚成纤维细胞上，形成的病毒蚀斑与HVT病毒蚀斑形态相似，经复制2～3代后，提纯病毒DNA，PCR扩增后电泳分析，凝胶上形成一条2．9kb左右的条带。将重组病毒负染后电镜观察，病毒粒子形态与HVT病毒相似，再将重组病毒的DNA进行测序，结果表明，gB基因已经重组在二价病毒中，并能够稳定遗传。     

利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株

通过对4株伪狂犬病病毒(PRV)流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP~+,然后利用环化重组酶(Cre)去除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10~(3.8 )TCID_(50)和10~(2.5 )TCID_(50),表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD_(50)和10LD_(50)强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。     

表达牛分枝杆菌MPB83基因重组腺病毒的构建

以牛分枝杆茵Vallee III株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得MPB83基因,克隆后.亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV中,构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MPB83经Pme I酶切,转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-I的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-MPB83.Pac I酶切线性化该质粒,转染AD-293细胞进行病毒包装,转染细胞10 d后出现细胞病变(CPE).PCR、RT-PCR、western blot检测到重组病毒含MPB83基因并成功表达.     

一株表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒的构建及其复制稳定性分析

为探寻伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点，在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白（Enhance Green fluorescent protein，EGFP）基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上，通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列，UL3序列替换右同源臂US2序列，并将PolyA引入转移质粒，得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞，经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间，并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快，接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8，接种后40 h达到最高滴度10^8.3 TCID₅₀/mL，与亲本毒的最高滴度接近，但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒，并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定，结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL，之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果，为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

多联重组痘苗病毒的构建及鉴定

构建含有埃博拉出血热病毒(Ebola hemorrhagic fever virus,EHFV)小片段分泌蛋白S基因、马尔堡出血热病毒(Marburg hemorrhagic fever virus,MHFV)GP基因、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus,SNV)G2糖蛋白基因及非洲欧尼恩病毒(Africa O’nyong nyong virus,O’NNV)E2蛋白基因的重组痘苗病毒。设计含EGFP筛选标记和4种外源基因的穿梭质粒,并利用同源重组技术、荧光筛选技术和Cre/LoxP敲除系统,最终获得四联重组痘苗病毒。使用PCR方法鉴定重组痘苗病毒及其遗传稳定性;用透射电镜观察病毒形态。结果显示:所构建的多联重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+具有良好的遗传稳定性,并且具备痘苗病毒的完整形态。结果表明:成功构建了含有4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+,为后续多联疫苗的研究奠定了基础。     

猪囊虫酸性核糖体磷蛋白基因P2重组杆状病毒的构建及鉴定

用O1igo(dT)软件设计了1对酸性核糖体磷蛋白P2(arpP2)基因特异引物，以pUCl8—P2为模板，经PCR扩增出366bP的猪囊虫arPP2片段，酶切回收后与经过相同处理的pFASTBAC供体质粒连接，转化DH5α感受态细胞；对重组质粒经酶切和PCR鉴定后再转化DHl0BAc感受态细胞，提取高分子BacmidDNA，用Lipofectin法转染Sf9单层昆虫细胞，待出现细胞病变后收集培养上清液，重新感染昆虫细胞，提取细胞DNA进行PCR鉴定，证明含有arPP2基因的重组杆状病毒成功地感染了昆虫细胞。     

标记辅助选择及其在动物育种中的应用

动物遗传标记的发展，到目前为止已经历了从形体特征到血液蛋白多态性，再到DNA多态性这样一个发展过程。20世纪70年代，限制性内切酶的发现及DNA重组技术的创立使DNA多态性成为一种新的标记形式，并逐步走向完善。DNA标记：即分子遗传标记技术的成熟使得畜禽数量性状图谱越来越系统化和完善，从而为畜禽改良提供了新的手段。     

大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性，实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条引物，采用突出末端PCR法和重组PCR法，将克隆于质粒pEWD299上的LT基因，分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点，扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112突变点的约1100bp和约800bp的DNA片段和不含突变点的约300bp的DNA片段，使控制LT毒力活性中心的第7位和第112位氨基酸的碱基分别发生诱变，各DNA片段经分熟、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后，插入经BamHI和XhoI双酶切的线性化的高效表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点区，使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达，将连接产物转化入JM105菌株，挑出可疑阳性菌落，提取质粒，经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析，证明读框正确，序列正确，获得了pGEX-4T-1(LT7t GEX-4T-1(LTm112两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人 动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂，完成了基因水平的工作。     

马Viperin的抗EIAV功能初步研究及其重组腺病毒的构建

Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。