多重RT-PCR区分PRRSV变异株和经典株方法的建立

根据GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和变异株基因序列,设计合成了2对引物,分别扩增NSP2和NSP9部分基因片段,建立了一种一次反转录后多重PCR鉴定区分PRRSV变异株和经典株的方法。该方法扩增PRRSV变异株时可获得380bp的特异性片段,扩增PRRSV经典株时则获得380bp和680bp两条特异性片段,根据RT—PCR产物可将两者区分开来。试验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点,是一种快速准确检测PRRSV的方法。     

PRRSV经典株和变异株RT-nPCR鉴别诊断方法的建立

【目的】建立一种能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,能够从病料组织、血清或精液中直接进行目的基因检测,达到快速诊断的目的。【方法】根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列,设计并合成了2对引物,通过改变不同的反应体系和反应条件,建立PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,并通过灵敏性试验、特异性试验、病料组织和血清或精液样品检测,验证建立RT-nPCR方法的适用性。【结果】建立了PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR诊断方法,该方法检测的cDNA含量极限为1.3×10-7 pg/μL;且仅能从PRRSV毒株中扩增到目的条带,从CH-1R经典株扩增出649bp条带,从SXXY/2013变异株扩增出562bp条带,电泳后能清晰区别,而从其他参考毒株中均不能扩增出目的条带。从48份疑似病料组织和血清中能直接检测出31份阳性结果。【结论】建立了一种灵敏度高、特异性好、可直接从病料组织和血清中快速鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-nPCR方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332bp（经典株）和241bp（变异株）,根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株和经典株RT-PCR鉴别诊断技术及其临床应用

【目的】建立能针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）经典株和变异株的RT-PCR鉴别诊断技术,为有效防控猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）提供技术支撑。【方法】根据GenBank中已发表的PRRSV Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别PRRSV经典株和变异株的RT-PCR诊断技术,并进行特异性、敏感性试验及临床应用。【结果】建立的RT-PCR能同时扩增获得两条大小与预期结果一致的特异片段,即332 bp（经典株）和241 bp（变异株）,根据其大小可将两者鉴别区分;而且具有较强的特异性和较高的敏感性,能同时检测出100 fg PRRSV经典株和变异株的RNA含量;临床应用发现37份可疑病料中PRRSV经典株占24.32%,变异株占51.35%,其余样品为阴性。【结论】该RT-PCR技术能有效鉴别PRRSV经典株和变异株,且具有快速简便、特异敏感的特点,在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

公猪精液PRRSV变异株检测及NSP2、ORF5基因序列分析

用荧光RT-PCR方法从某猪场精液中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异株(NSP2 1 594～1 680 bp缺失)核酸阳性.提取1份阳性样品病毒核酸测定和分析其NSP2和OBF5全基因序列,结果表明NSP2基因由950个氨基酸组成,与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比481位缺失1个氨基酸、532～560位连续缺失29个氨基酸,与JXA1、HUN4等毒株具有相同的缺失特性;ORF5基因第13、151位为具有强毒特性的精氨酸(R),存在4个潜在的糖基化位点,分别位于30～32、35～37、44～46和51～53位氨基酸.遗传进化分析表明,测定序列与JX-A1、HUN4等毒株关系最近,与CH-1a、NVSL等同属一个大分支,而与BJ-4、P129、RespPRRS MLV、VR-2332等处于不同分支.研究证实公猪精液可携带PRRSV变异株,因此猪场(群)在人工授精和引进精液时必须强化检疫和生物安全措施.     

高致病性PRRSV缺失变异株Nsp2基因的克隆与遗传变异分析

从湖南省内多个出现疑似猪“高热病”症状的猪场采集病料70份,采用RT-PCR方法进行分子流行病学调查．结果检出PRRSV阳性病料54份,阳性率高达77．14％（54／70）．对其中8份分别来自娄底、浏阳、永州、双峰、益阳、株洲、宁乡和溆浦的病料中的PRRSV基因组Nsp2高变区部分基因片段进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析．与国内外美洲型PRRSV分离株比较,序列相似性为72．2％～100％,其中,与公布的高致病性PRRSV缺失变异毒株的同源性最高,序列相似性为98．2％-100％．序列分析表明,这些毒株均是天然存在缺失的变异毒株,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,与高致病性PRRSV缺失变异毒株序列的缺失情况完全一致,且与其具很高的同源性,从而确定了分离的毒株均为引起猪“高热病”的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株,这是国内外少见的PRRSV缺失变异及毒力显著增强的现象．     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株自然感染病例的病理分析

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异毒株的致病特点,为其发病机制研究提供重要资料。对临床感染病例的肺脏、脾、肾、淋巴结等组织进行了显微和超微病理结构变化的观察。PRRSV变异毒株的病理损伤以间质性肺炎和全身性急性淋巴结炎为特征,伴有肝、脾、肾、心脏、胃和肠等器官的变性坏死;肺泡巨噬细胞、淋巴结及脾脏中的淋巴细胞和浆细胞均被不同程度的感染,并含有大量病毒包涵体。研究表明,PRRSV变异毒株的组织嗜性与中国典型毒株ch\|1a相比已有较大的改变,其感染会引起全身性免疫抑制。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物.分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PER条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PER诊断方法.应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株.试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PER诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的致病性试验

【目的】研究从江西、湖南发生持续高热的病猪体内分离的4株NSP2基因缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2的致病力。【方法】通过Reed-Muench法,测定4株PRRSV(第3代)的TCID50,将毒株分别接种PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原与抗体均为阴性的健康猪,各设同居试验猪,通过检测体温、临床症状观察、RT-PCR、ELISA、病理切片等方法检测病毒的致病性。【结果】4株病毒的TCID50为10-3.75~10-4.5/mL。攻毒试验猪和同居试验猪均表现典型猪繁殖与呼吸综合征临床症状,最后试验猪均死亡。病理切片也显示典型的猪繁殖与呼吸综合征病理变化,并在脑组织内检测到PRRSV核酸。【结论】4株PRRSV分离株的致病力增强。     

PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法的建立与应用

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的nsp2基因序列,在nsp2大缺失区下游的保守区设计了1条下游引物,在小缺失区设计1条上游引物,用于变异株的扩增。在大缺失区内部设计1条上游引物,与变异株共用下游引物,用于普通株的扩增,建立了PRRSV变异株与普通株二重RT-PCR鉴别方法。建立的RT-PCR方法用于临床病料的检测,部分阳性结果测序,变异株序列与报道的序列同源性在97%以上。结果表明,该方法特异、快速、简便,可以用于PRRSV变异株和普通株的鉴别。     

新疆高致病性猪蓝耳病病毒分离与鉴定

从新疆发病仔猪的肺脏和淋巴结内体内分离到1株PRRSV病毒.该病毒能直接在Marc-145细胞上生长,继代培养72 h后产生细胞病变(CPE).经特异性荧光抗体和ELISA检测均为阳性,RT-PCR方法能扩增出该病毒的400 bp的特异性片段.从该病的流行病学、临床症状、病理学、病原的生物学特征来看,该分离株为猪繁殖与呼吸综合症病毒的变异株.这一结果提示PRRSV毒株变异是引起新疆地区猪场母猪、仔猪大量发病死亡的重要原因,必须引起各级兽医部门和猪场的高度重视.     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

豫西地区PRRSV新近流行株ORF5基因变异及Nsp2基因特征分析

为研究豫西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新近流行株ORF5基因的变异情况及Nsp2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了26份近期采自豫西地区猪场疑似PRRS猪肺脏样品中的ORF5全序列和Nsp2部分序列,并对其生物信息学和结构进行了分析。结果表明:成功扩增出的21株PRRSV流行株间ORF5全基因同源性为96.6%～100%,氨基酸同源性为97.5%～100%;与参考毒株JXA1、MLV、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为96.6%～98.9%、88.4%～89.2%、88.0%～89.5%和66.8%～67.3%;对阳性病料进行了部分Nsp2基因的扩增,测序结果显示,所有流行株的Nsp 2基因与已报道的美洲株VR-2332相比,不存在核苷酸的插入或突变,但存在2个位点共90个碱基的缺失;遗传衍化分析表明,流行毒株属于美洲型。研究结果揭示了豫西地区新近流行的PRRSV ORF5基因的变异情况及Nsp 2基因的特征,为该地区的PRRS防控工作提供了理论依据。     

PRRSV陕西分离株ORF5基因克隆、序列分析及原核表达

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因,并进行序列分析及原核表达。根据GenBank公布的PRRSV ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株糖基化囊膜蛋白基因ORF5,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。再设计另外1对引物扩增ORF5缺失编码N端31个氨基酸残基的基因片段,将截短的ORF5基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达。结果扩增到603 bp的PRRSV全长ORF5基因,序列分析表明,分离株与北美型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%。因此推测陕西分离株属于北美型。SDS-PAGE可检测到大小约为38 ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。West-ern-blot分析表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。     

1株PRRSV类NADC30毒株的分离鉴定及序列分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异情况,将PRRSV阳性病料处理后接种Marc-145细胞,成功分离到1株PRRSV毒株,将其命名为HENZXC-4,并对其全基因组序列进行测定和分析。结果表明,HENZXC-4为未发生重组的类NADC30毒株,其NSP2蛋白存在131个氨基酸不连续缺失,且其GP5蛋白存在1个氨基酸插入。     

呼吸道综合症病猪群病原检测与分析

应用PCR技术和免疫荧光试验对福建省某猪场以呼吸道症状为主的发病猪群进行多重病原检测和人工感染病猪肺脏淋巴结等器官的病理组织学观察。结果显示:病猪肺脏和淋巴结等病料匀浆的RT-PCR检测为PRRSV变异株阳性,但PRV、CSFV、PCV2及SIV均为阴性;免疫荧光试验结果与RT-PCR一致;将阳性病料接种Marc-145分离到1株病毒,人工感染断奶仔猪能复制出与临床自然病猪相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒;病理组织学观察显示人工感染濒死猪肺脏呈间质性肺炎病变。综合分析上述结果初步表明该猪群暴发的呼吸道疾病主要是由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异型引起。     

PRRSV阳性血清驯化对后备母猪繁殖性能的影响

[目的]对比分析猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)阳性血清驯化和疫苗免疫两种方式对猪场后备母猪免疫抗体水平及繁殖性能的影响,为规模养殖场选择适宜免疫方式防控猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)提供参考依据.[方法]以血清驯化和疫苗免疫两种方式分别免疫90日龄后备母猪,1个月后经前腔静脉窦采血检测抗体水平,同时测定后备母猪第一胎的受胎率、分娩率、胎产仔数、胎产活仔数、产弱仔率、产死胎率、产畸形及木乃伊率等繁殖性能指标.[结果]血清驯化与疫苗免疫后备母猪的血清抗体阳性率分别为100.00%和99.30%,但疫苗免疫后备母猪的抗体水平离散度相对较低,且较集中.血清驯化与疫苗免疫后备母猪第一胎的受胎率(96.79%vs 97.11%)、分娩率(88.55%vs 88.96%)、胎产仔数(11.26 vs 11.41)、胎产活仔数(10.3 vs 10.5)、产弱仔率(3.61%vs 3.32%)、产死胎率(2.96%vs 2.99%)、产畸形及木乃伊率(4.35%vs 4.13%)相近,二者差异不显著(P>0.05),但均优于对照后备母猪.[结论]在确定养猪场内只流行一种血清型PRRSV时,可采用血清驯化替代疫苗免疫防控PRRS,除了能有效提高后备母猪的繁殖性能外,还具有成本低廉、操作简单的特点.     

2007－2009年部分猪群PRRSV ORF5和Nsp2基因的克隆与序列分析

【目的】了解2007-2009年部分猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株的遗传演化规律。【方法】按常规方法,从2007-2009年收集的疑似蓝耳病猪群组织样品中分离PRRSV,应用RT-PCR方法,对分离的10株PRRSV的ORF5和Nsp2基因进行扩增,测序后与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2基因进行核苷酸、氨基酸序列比较及遗传进化分析。【结果】分离到的SDWF5、SDCX1、LN3、LN8、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB1、ZB2共10株PRRSV均属于美洲型PRRSV变异株,其ORF5基因全长均为603bp,编码约200个氨基酸,其推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;SDWF5、SDCX1、LN3、LN12、SD2、SD5、SD14、ZB2等8个分离株的Nsp2基因全长为2845bp,编码950个氨基酸,与代表毒株VR-2332相比,8个分离株在Nsp2基因推导氨基酸序列的480和532～560位发生了不连续的30个氨基酸缺失。与19个PRRSV参考毒株的ORF5、Nsp2序列进行比较后发现,10个分离株的ORF5、Nsp2基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列均发生了较大变异。遗传进化分析发现,10个分离株与以CH-1a为代表的国内流行毒株处于同一分支,与JXA1等变异毒株的遗传距离较近。【结论】来源于不同猪群的10个PRRSV分离株的遗传关系存在交叉,没有明显的地域特征,但可能具有相同的始祖Ch-1a。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州流行株ORF5序列变异分析

通过RT-PCR扩增9株贵州省PRRSV流行毒株的ORF5基因,并将其连接到pMD18-T载体进行克隆测序得到目的基因序列.参考国内外毒株,分析其变异特点.结果表明,9株PRRSV贵州流行株都属于美洲型毒株,其ORF5序列之间同源性为99.5%~100.0%.以GZCJ株为贵州省代表毒株,与美洲型参考毒株之间的同源性为89.7%~98.7%,与近年流行的毒株遗传距离较近,与早期流行毒株遗传距离较远,其发生了大量点突变.     

PRRSV陕西分离株ORF3基因的克隆、序列分析及原核表达载体的构建

根据GenBank公布的PRRSVORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株ORF3基因,将其克隆入pGEM-T载体中,测序并进行序列分析。再将ORF3基因亚克隆入pET-32a中,构建原核表达载体。结果扩增到765 bp的PRRSV全长ORF3基因,序列分析结果表明,分离株与SY0608亲缘关系较近,而与CH-2、HB-2关系较远。重组原核表达质粒经酶切鉴定正确后命名为pET-GP3,为进一步研究GP3蛋白的原核表达、免疫特性、结构与功能奠定了基础。