CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用

CRISPR/Cas9系统是近年发展起来的、由导向RNA介导的基因组定向编辑技术。总结了CRISPR/ Cas9基因组定向编辑技术的发展历程,并综述了其在作物遗传育种研究中的多方面应用。CRISPR/Cas系统是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种后天免疫系统,以消灭外来质体或者噬菌体。 根据Cas蛋白组分及氨基酸序列不同,已发现的CRISPR/Cas系统可以分为3种不同类型,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,Ⅱ型是以Cas9蛋白及导向RNA为核心组份,组成较为简单,是目前经过改造用于开发基因组定向编辑技术的主要类型。自CRISPR/Cas9技术体系首先在人类与动物细胞系中建立后,经过改造的CRISPR/Cas9系统被迅速地应用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中。CRISPR/Cas9与ZFNs或TALENs一样都是通过自身的核酸内切酶活性引起靶位点DNA序列双链断裂,然后通过非同源末端连接或同源重组介导的修复2种方式引入突变。至今,在多种作物中已实现诱导产生多种定点突变（包括插入、缺失或修饰等）,并可获得较高的突变诱导率和可稳定遗传的基因组编辑后代植株。与ZFNs或TALENs技术相比,CRISPR/Cas9技术可以实现对基因组中多个靶基因同时进行编辑,从而可以用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因,为其一大优势。由于CRISPR/Cas9技术具有突变诱导率高、成本低、易于操作及可以多重基因编辑等特点,已成为具有广阔应用前景的作物遗传改良与育种研究的分子操作系统。CRISPR技术除了可以对基因组中不同靶基因进行定向编辑以外,还可以广泛地应用于基因表达调控研究、细胞定位运输系统研究及新型RNA沉默系统构建等方面。基因组编辑技术是继转基因技术之后人类对生物进行遗传操作的又一个革命性技术。但是,与转基因技术相比,CRISPR/Cas9基因组编辑技术操作更加简单、快捷。应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行育种可以不引入外源基因,在进行基因组编辑之后可以不留下转基因的痕迹,从而导致定义转基因生物的不明确性,因此,政府监管部门是否应该按照转基因的管理办法来监管CRISPR/Cas9技术的应用尚有待决定。     

CRISPR/Cas9系统研究进展及应用

CRISPR/Cas9是目前应用广泛的基因组编辑工具,该系统利用一段RNA引导Cas9核酸酶可对多种细胞及动植物基因组实现特定位点的切割和修饰,具有操作简单、作用高效等优点。Ago是另一类核酸内切酶,具有良好的应用潜力。从CRISPR/Cas9的发展现状、结构基础、作用机制、改进后的基因编辑机制及基因编辑技术的应用等方面进行了综述,讨论其存在的问题,并提出相应对策。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。     

基因编辑CRISPR/Cas9技术在农业领域的应用

CRISPR/Cas9系统通过靶向突变对植物基因组进行编辑,是研究基因功能和作物改良的第三代基因编辑工具。本文介绍了CRISPR/Cas9打靶系统基本结构、工作原理,并展示了其在作物基因功能研究和品质改良中的应用前景。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物病原真菌中的应用研究进展

CRISPR/Cas9是在细菌、古细菌基因组中含有的一种成簇有规律的间隔短回文重复序列,该结构被其用于抵御外来微生物基因入侵。通过对上述结构进行改装从而形成一种基因编辑方法,与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术具有更高效的优势。本文以CRISPR/Cas9系统的组成、作用机制和运用原理为切入点,系统总结了该技术在植物病原真菌(稻瘟病菌、橡胶树胶孢炭疽菌、玉米黑粉病菌等)中的致病相关基因组定点编辑应用情况,明确了当前在植物病原真菌中应用CRISPR/Cas9系统的编辑效率整体较低,不同sgRNA设计工具、目的等对编辑效率、靶向特异性的潜在影响,以及宏观突变检验方式的偏差问题等局限性,并提出了该系统应用范围的扩大、编辑效率的提高以及新型编辑方式的挖掘等建议与展望。     

CRISPR/Cas9系统及其在作物育种中的应用

基因编辑是一项对目的基因进行修饰的新技术,由成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly in-terspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其关联蛋白(CRISPR associated,Cas)组成的系统(CRISPR/Cas)为新一代基因编辑技术,其中Cas9蛋白与CRSPR结合形成的编辑系统CRISPR/Cas9因其简单易操作的特性已广泛应用于植物基因组编辑,发展潜力巨大.文章论述了CRISPR/Cas9系统的作用原理、发展历程及在植物基因组中的定点编辑效应,并分析CRISPR/Cas9在水稻、小麦、玉米等作物育种中的应用现状,发现其在改良水稻产量和质量相关性状、小麦白粉病抗性及玉米乙烯敏感等性状上效果明显.在今后的研究中,应针对不同作物的育种目标,深入了解目标基因的功能作用来设计相应的操作方案,并提高该系统对作物目的基因改良的效率,加强其安全性等,以促进基因编辑在作物育种中的应用,加快育种进程.     

CRISPR/Cas9系统介导的植物基因组编辑及其应用

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统是在细菌和古细菌中发现的一种抵抗病毒及质粒入侵的获得性免疫系统。该系统由sg RNA(single guide RNA)及Cas9核酸酶组成,具有可操作性及效率高的优点,已被成功运用于多种植物基因组编辑,如小麦、水稻、玉米等。本文简要阐述了CRISPR/Cas9系统的发现、分类、结构及作用机制,重点综述了CRISPR/Cas9系统在植物方面的研究进展及前景,以期为利用基因组编辑技术改良农作物的产量、品质、抗病性等重要农艺性状提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在昆虫基因功能研究中的应用及优化

主要概述了CRISPR/Cas9技术应用于涉及鞘翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目、直翅目和双翅目的昆虫在色素沉着、抗性、嗅觉、交配和性别发生等方面的研究进展，包括基因敲除和基因敲入技术的应用，同时总结了目前CRISPR/Cas9系统的优化方案，最后对改良CRISPR/Cas9系统在昆虫基因组学研究和农业害虫防控的应用前景进行了展望。利用基因编辑技术对昆虫基因功能进行探究是除基因过表达、RNA干扰等方法外的一种有效策略。CRISPR/Cas9技术是近年来出现并迅速发展的第三代基因编辑工具，以操作简便、成本低和编辑效率高等优点而被广泛应用于生物科学中的各个分支。     

基因编辑技术及CRISPR/Cas系统在草地植物开发中的应用

随着高通量测序技术的兴起,功能基因组学研究得以迅猛发展.基因组定点修饰技术作为一项研究特定基因功能的工具,对功能基因组学的研究具有极强的推动作用.CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫防御系统,在细菌、古细菌的长期演化过程中形成,用于对抗入侵的病毒及外源DNA.通过对各种基因编辑技术的对比,发现相比于DNA同源重组、锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等技术,基于RNA指导的CRISPR/Cas系统为基因组定点编辑开辟了一条新的道路,在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等显著优点.从作用机制和发展历程等方面对目前基因编辑的4种技术进行简述,进一步总结CRISPR/Cas系统在经济林木、作物、植物病毒和牧草植物功能基因组编辑中的研究应用,以期为促进基因编辑技术在农牧生产中的应用提供参考.     

十堰市樱桃产业发展的思考

针对湖北省十堰市樱桃[Cerasus pseudocerasus(Lindl.)G.Don]产业发展上存在的管理粗放、采摘难度大、销售困难、加工业规模小等问题,为发挥十堰市发展樱桃的优势,提出了综合规划、合理布局、加强培训、科学管理、推广避雨栽培模式、做大做强贮藏加工业的发展建议。     

Class2 CRISPR-Cas系统发掘及分析方法

近年来,规律间隔成簇短回文系统(CRISPR-Cas)作为基因编辑手段在动植物基因编辑中已广泛应用.现已被证实的Class2类CRISPR-Cas系统CRISPR-Cas 12、CRISPR-Cas 14等均通过生物信息学手段被发掘出来,因此,生物信息学成为发现新CRISPR-Cas系统及其子类型的重要方法.笔者综述了...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展及其在植物中的应用

CRISPR/Cas9系统可以对目标基因进行定向编辑，在植物基因功能研究和遗传改良中具有巨大的潜在应用价值，因其具有高效、操作便捷及成本低的特点，成为当前基因组编辑技术的主流。概述了CRISPR/Cas9系统的起源、分类、作用机制及其在农作物和林木基因功能验证和遗传改良中的应用，并对未来需要完善的相关问题和发展趋势进行了探讨。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用与政策监管

基因编辑技术是一种在基因组水平上对DNA序列进行精准修饰,从而促使基因组序列定向改造的技术。随着近几年CRISPR/Cas9技术的快速发展,基因组编辑技术在作物育种领域发挥了越来越重要的作用。本文综述了基因编辑技术的发展历程,以及CRISPR/Cas9的工作原理,分析了CRISPR/Cas9的局限性并提出了改进方法。重点阐述了植物CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立、在植物性状改良方面的应用,以及最终致力于基因编辑产品商业化的应用案例。同时还分析了美国、欧盟、英国、日本和中国这5个代表性国家/地区的基因编辑监管政策和态度,以期为我国科学监管框架的建立提供参考,促进CRISPR/Cas9在我国乃至全球的产业化应用。     

CRISPR/Cas9技术在家禽育种方面的应用

作为一种重要的基因工程技术,基因编辑自出现以来一直倍受关注.近年来,基因编辑技术发展更为迅速,从锌指核酸酶技术(ZFN)的开发利用到转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术的熟练运用,再到规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)技术的发现,基因编辑技术在不断地自我更新和完善的过程中推动着生命科学的发展和进步.综述了...     

基因编辑技术及其在作物育种中的应用与安全管理

基因组编辑技术是研究基因功能和对生物体基因进行定向改造的有力工具。随着近几年CRISPR/Cas9技术的快速发展,基因组编辑技术在作物育种领域起着越来越重要的作用。介绍了ZNFs、TALENs和CRISPR/Cas9系统的原理及在作物育种领域的研究进展,重点论述了CRISPR系统相关的变体和该系统在植物基因功能研究和作物育种中的进展。同时,也论述了基因编辑作物的检测方法及不同国家和地区对基因编辑作物的监管态度,重点介绍了美国、欧盟以及我国目前的监管态度,并分析了基因编辑作物存在的问题和发展趋势。为我国基因编辑作物的研究、安全管理和商业化批准提供了参考。     

靶向加工番茄elF4E1的CRISPR/Cas9载体有效性验证

【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。     

一种CRISPR-Cas9介导的拟南芥高效基因编辑系统的构建与应用

【背景】近些年兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种植物中实现了高效的基因打靶,为基因功能研究提供了一种高效快速的方法,但一些CRISPR-Cas9载体编辑效率很低。【目的】通过构建一种由RIBOSOMAL PROTEIN S5 A（RPS5A）启动子启动Cas9并带有红色荧光蛋白筛选标记的CRISPR-Cas9载体,提高拟南芥CRISPR-Cas9编辑效率,并利用这套系统对拟南芥木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因TOUCH4（TCH4）进行编辑。【方法】在pKSE401载体的基础上,以从胚胎发育早期就表现出高转录活性的RPS5A启动子替换35S启动子、以DsRed2替换潮霉素抗性基因,构建拟南芥中使用的CRISPR载体pRSE-WH;以AtTCH4为靶基因,使用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn）设计靶位点,将所设计的靶点序列在拟南芥参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出2个靶位点target 1和target 2。化学合成带有接头的靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pRSE-WH载体连接,构建TCR1和TCR2表达载体,采用农杆菌介导的沾花法侵染野生型拟南芥Col-0,以红色荧光蛋白为标记筛选获得T₁代转基因阳性植株。通过靶位点扩增测序法判断T₁代转基因植株在预期靶位点是否发生编辑,根据测序结果的峰图对编辑情况进行解码,进一步分析突变类型及基因型。【结果】构建了一个在拟南芥中高效编辑的CRISPR载体pRSE-WH。TCR1和TCR2成功地实现了对TCH4的定点编辑,靶点一的编辑效率为80%,靶点二的编辑效率为100%,总编辑效率为86%。根据测序结果的峰图解码了T₁代植株的突变结果,纯合编辑、杂合编辑、双等位编辑均有出现。对不同的编辑类型进行统计发现,59株T₁代阳性植株中,无编辑8株,占比13.56%,纯合编辑9株,占比15.25%,双等位编辑40株,占比67.80%,杂合编辑2株,占比3.39%。在T₁代发生纯合编辑以及双等位编辑的株系中选择了无红光种子进行繁种,并对T₂代植株编辑情况进行测序检测,结果发现T₁代中的突变成功遗传到了T₂代无Cas9株系中。【结论】pRSE-WH在拟南芥中展现了极高的编辑效率,并且通过对种子进行红色荧光筛选,能够简便地获得无Cas9且稳定遗传的T₃代突变体。