紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因的表达及抗逆性分析

根据NCBI中紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(MET1, 登录号:AF189766.1)cDNA序列设计一对特异性引物,以紫花苜蓿品种“农菁1号”的cDNA为模板,利用PCR技术克隆出的一个基因,命名为MsMT1,测序发现该基因全长228 bp,编码75个氨基酸。通过碱基序列比对发现MsMT1与MET1的相似度为99%。通过氨基酸序列分析和进化树分析,发现与其他植物的1型金属硫蛋白基因具有较高的同源性。利用qRT-PCR对MsMT1在苜蓿不同器官中的表达进行分析,发现该基因在根和子叶中表达量较高。将苜蓿幼苗进行不同浓度NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃及不同pH值胁迫处理后, 观察MsMT1基因的表达,发现MsMT1的表达量随盐碱处理液浓度和pH值变化发生改变,说明MsMT1与植物的抗逆性相关。采用农杆菌介导法将MsMT1导入苜蓿植株体内,卡那抗性的筛选和Northern blot结果显示MsMT1基因能够在转基因苜蓿中高效表达。用不同浓度NaCl、NaHCO₃处理野生型和转化MsMT1基因的苜蓿幼苗,观察幼苗受胁迫后的表型,发现转基因的苜蓿幼苗比未转基因的苜蓿幼苗抵抗力高。本研究表明MsMT1基因能够增加苜蓿对胁迫的抗性。     

碱茅PutSnRK2基因表达、克隆及其蛋白纯化

从NaHCO_3逆境胁迫下碱茅(Puccinellia tenuiflora)的cDNA文库中克隆得到PutSnRK2基因全长cDNA。PutSnRK2基因序列中存在1 077bp的开放阅读框,编码358个氨基酸,预测蛋白分子量为41.11kDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR分析表明,在NaHCO_3、NaCl、ABA和PEG胁迫下,PutSnRK2基因在碱茅叶、根中均受到显著诱导(P0.05)。同时用pGEX-6p-3载体构建了PutSnRK2基因的原核表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达纯化得到GST-PutSnRK2融合蛋白,为后续试验分析PutSnRK2蛋白的激酶活性、验证蛋白间的相互作用等研究奠定了基础。     

碱蓬根际和内生细菌菌株对盐碱胁迫下苜蓿生长的影响

为研究碱蓬根际和内生细菌菌株对盐碱胁迫下苜蓿幼苗生长的影响,试验以龙牧801紫花苜蓿为供试品种,将前期从碱蓬根内(JG1)、根际土壤(JT4)和茎内(JJ5)筛选出的具有较强耐盐碱胁迫能力的根际及内生细菌菌株接种于苜蓿幼苗根部。接菌1周后将中性盐(NaCl、Na₂SO₄)和碱性盐(NaHCO₃、Na₂CO₃)按NaCl∶Na₂SO₄∶NaHCO₃∶Na₂CO₃=9∶1∶1∶9混合,并设置0、100、150、200 mmol·L^-1盐碱浓度溶液浇灌苜蓿幼苗根部,进行盐碱胁迫处理。分析盐碱胁迫下碱蓬根际及内生细菌菌株对苜蓿生长及生理的影响,并通过隶属函数和主成分分析综合评价碱蓬根际和内生细菌菌株对盐碱胁迫下苜蓿生长的影响。结果表明:3株促生细菌均能缓解盐碱胁迫对紫花苜蓿生长的抑制作用,促进紫花苜蓿生长,不同促生细菌对盐碱胁迫下苜蓿促生效果为JT4>...     

紫花苜蓿二氢黄酮醇还原酶基因(MsDFR)的克隆与分析

二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)是缩合单宁生物合成途径中的关键酶,在单宁的合成中起着重要的作用。根据同源克隆的原理,利用RACE技术,从“中苜一号”苜蓿中克隆得到DFR基因(MsDFR),并对其进行了序列分析及不同胁迫条件下的表达模式分析。结果表明,MsDFR基因cDNA全长1 402 bp,包括开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸,在N端存在1个NADP结合位点“VTGASGFIGSWLVMRLMERGY”,中部存在1个底物特异性结合的氨基酸基序“TLNVTEDQKPLWDESCWSDVEFCRRV”。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在荚果中表达量较高,根中较弱;在NaCl和GA₃诱导下,MsDFR基因表达受到抑制;在黑暗条件下,该基因被诱导表达。由此推测“中苜一号”苜蓿中可能存在不依赖于GA₃信号的单宁合成途径。     

盐生植物小花碱茅K+通道PtAKT1基因片段的克隆及序列分析

为研究小花碱茅(Puainellia tenuiflora)K⁺/Na⁺选择吸收分子机制,根据已报道的其他植物AKT1基因的保守序列设计一对简并性引物,以小花碱茅根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出AKT1基因,以期为小花碱茅AKT1全长基因的克隆、表达调控及其作物改良的研究奠定基础。序列分析结果表明:该基因长度大约为1019 bp,编码339个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物AKT1基因序列的同源性均在85%以上,与其他AKT1的氨基酸序列同源性达73%以上。     

60Co-γ辐射对三种盐碱胁迫下稗草种子萌发的影响

为确定有助于提升稗草种子耐盐性的⁶⁰Co-γ射线辐射剂量,对不同浓度NaCl、NaHCO₃和NaCl+NaHCO₃胁迫下种子发芽率的变化进行分析,确定了3种盐碱的半致死浓度,同时对不同剂量辐射处理的种子进行3种盐碱胁迫处理,比较辐射种子在3种盐碱胁迫下种子萌发和芽苗生长的影响。结果表明,3种盐碱胁迫的半致死浓度分别为280 mmol·L^-1NaCl、80 mmol·L^-1NaHCO₃和280 mmol·L^-1NaCl+70 mmol·L^-1NaHCO₃;适宜辐射剂量可以促进NaCl胁迫下种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数及芽苗总长、胚芽长、根长、鲜重、干重、相对含水量和NaCl+NaHCO₃胁迫下种子的发芽率、发芽指数和芽苗干重,NaHCO₃胁迫抑制种子萌发和芽苗的生长,增加芽苗鲜重、干重和相对含水量。不同辐射剂量对3种盐碱胁迫种子萌发和芽苗生长各指标的影响不同,隶属函数综合分析,辐射剂量在50,100和150 Gy能提高稗草种子耐NaCl能力,但辐射不能提高其耐NaHCO₃和混合盐碱能力。     

盐胁迫对新麦草种子萌发特性和生理特性的影响

采用浓度为0%、0.3%、0.%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%的NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃单盐胁迫新麦草种子,通过种子萌发特性和生理特性的变化,研究其萌发时的耐盐能力和不同盐分对其危害程度,为新麦草(Psathyrostachys juncea(Fisch.) Nevski)在盐碱地的建植提供参考.结果表明:3种盐胁迫对新麦草种子的发芽率、发芽势、根生长速度和幼苗生长速度的影响差异明显.相同浓度下,Na₂CO₃胁迫时发芽率和生长速度受到显著抑制(P<0.05),MDA的积累量大.可溶性糖、CAT、POD、SOD在Na₂CO₃浓度为0.%时达到最大值;NaCl胁迫时MDA的积累量最小,发芽和生长受到的影响较小,可溶性糖和CAT在NaCl浓度1.5%时达到最大值,POD和SOD在浓度1.2%时达到最大值;NaHCO₃胁迫时受到的抑制介于中间.综合分析,3种盐对新麦草种子萌发影响的强弱顺序为:Na₂CO₃＞NaHCO₃＞NaCl.     

星星草PtGAPDH基因的克隆与表达分析

本试验利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)克隆技术从星星草中克隆得到抗盐碱相关基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的cDNA全长序列,其GeneBank登录号为JX411954。PtGAPDH基因开放阅读框为1014 bp,编码337个氨基酸。该氨基酸序列与高羊茅、大麦、小麦、水稻等禾本科作物具有较高的序列相似性。系统进化分析表明,PtGAPDH基因编码蛋白与单子叶植物的GAPDH具有较近的亲缘关系。Northern杂交分析显示,在一定盐碱胁迫条件下,随着处理试剂Na₂CO₃溶液浓度的增加,PtGAPDH基因在盐碱胁迫下的叶片和根部表达量都显著升高;超过最大耐受量后,PtGAPDH基因表达丰度逐渐降低。PtGAPDH基因的表达模式代表了星星草在盐碱胁迫下其自身的生理生化变化对分子水平上的基因表达丰度产生的影响趋势。     

Na2CO3和NaHCO3胁迫下冰草的生长及生理响应

在温室条件下用不同浓度的Na₂CO₃和NaHCO₃ (0,30,60,90,120,150 mmol/L)对冰草进行胁迫,测定冰草的生长及生理指标。结果表明,在2种碱处理下随着胁迫浓度递增,冰草的丙二醛含量和可溶性糖含量增加,生物量、根冠比、叶绿素含量、脯氨酸含量都呈先增后降的变化趋势。低浓度的碱胁迫对冰草生长有一定的补偿生长作用,碱胁迫下脯氨酸先于可溶性糖而累积, Na₂CO₃对冰草的胁迫作用大于NaHCO₃。     

三种药用甘草种子对盐渍环境的萌发响应及其适宜生态种植区

根据西北地区盐碱土的盐分组成特点,选择NaCl、Na₂SO₄、NaHCO₃ 3种单盐,通过盐胁迫下3种药用甘草种子萌发特性、萌发进程、胚生长、种子活力及复水后萌发率的差异分析,比较3种药用甘草种子对不同土壤盐分的萌发响应、耐盐阈值及其适宜盐碱地种植区,为盐碱地种植药用甘草适宜生态区的选择提供理论参考。结果表明,3种单盐胁迫不同程度降低了药用甘草种子的萌发率,延长种子的萌发时间,抑制胚轴伸长生长,盐害强弱顺序为:NaHCO₃＞Na₂SO₄ ＞NaCl。NaCl和Na₂SO₄对药用甘草种子萌发的抑制效应主要为渗透效应,盐胁迫解除复水后种子萌发恢复率为50.6%～78.5%;NaHCO₃ 对药用甘草种子萌发的抑制效应主要为离子毒害,种子萌发恢复率仅为5.1%～21.5%;胀果甘草耐盐性最强,适宜在以氯化物-硫酸盐为主的总盐量为0～1.3%的区域种植,光果甘草耐NaHCO₃最强,可在含小苏打的弃耕低盐地种植,乌拉尔甘草耐盐性最弱,种植地土壤的总盐量范围在0～0.7%为宜。     

四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达

脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用。为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景,本研究设计了一对简并引物,通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2。该基因cDNA全长为867 bp,共编码242个氨基酸。序列BLAST比对与同源性分析结果表明,该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性。利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现,AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达,且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导,表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应。     

羊草乙醛脱氢酶基因LcALDH的克隆与表达分析

采用RACE技术从羊草中克隆了乙醛脱氢酶基因LcALDH的cDNA(GenBank登录号EF492045)。长为1 712 bp的LcALDH cDNA序列含有编码500个氨基酸的1 503 bp的开放读码框、66 bp的5′非翻译区和144 bp的3′非翻译区。氨基酸序列中含有醛脱氢酶家族绝对保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。分析LcALDH基因在不同胁迫条件下的表达情况,结果表明,LcALDH的表达受到低温、干旱、高盐和ABA的正调控作用。研究结果为进一步从分子水平探明羊草的抗逆机制,挖掘并利用植物抗逆基因奠定基础。     

羊草根、叶在干旱和盐胁迫下的生理反应

我国北方干旱气候和盐渍化土地严重限制了羊草(Leymus chinensis)生长,为探究羊草在逆境下根、叶的联系与区别,为提高羊草耐盐性和耐旱性提供理论依据,本研究通过设置不同浓度PEG(20%、30%、40%、50%)溶液和NaCl溶液(100、200、300、400mmol·L~(-1)),模拟不同程度干旱和盐生境,测定干旱胁迫和盐胁迫下羊草根、叶抗氧化酶系统(APX、CAT、POD)活性和可溶性蛋白含量的变化,对比羊草根、叶在胁迫下的生理反应。结果显示,轻度盐胁迫下(100mmol·L~(-1)),羊草主要通过叶片的APX消除活性氧自由基,渗透调节部位主要在叶片中;中度盐胁迫(200、300mmol·L~(-1))下,根部、叶部分别主要通过提高POD和CAT活性来消除活性氧;胁迫严重时(400 mmol·L~(-1)),根部APX显著升高,叶片则通过提高POD和CAT活性共同抵抗活性氧的危害,渗透调节也会从叶片转为根、叶共同作用。干旱胁迫初期(20%),羊草主要依靠根、叶中的APX和叶中的CAT来消除活性氧,随着胁迫加重,根中的APX和叶中的CAT活性提高,共同抵抗活性氧危害,根、叶中POD活性一直呈下降状态,对抵抗活性氧自由基伤害作用不大,渗透调节部位主要在叶片中。     

桑树Ca~(2+)/H~+反向转运体基因MCAX-1的克隆及序列与表达分析

植物体内的Ca2+/H+反向转运体在Ca2+介导的营养和信号转导中发挥着重要作用。选择桑树幼叶cDNA文库中功能注释为Ca2+/H+反向转运体基因(CAX)的一条EST序列设计引物,通过cDNA末端快速扩增(RACE)与反转录PCR(RT-PCR)在桑品种育71-1的幼叶中克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为MCAX-1(GenBank登录号:JN716318)。序列分析显示:MCAX-1全长1 784 bp,包括197 bp的5'端非翻译序列和243 bp的3'端非翻译序列,含有一个1 344 bp的完整ORF,编码447个氨基酸残基,预测蛋白质分子质量为47.93 kD,等电点为5.67。构建的桑树和其它植物基于CAX蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树与盐地碱蓬(Suaeda salsa)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)等有较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析表明:MCAX-1在桑树幼芽、嫩叶、根和幼花中的表达量较高,在韧皮部、木质部和成熟果实中的表达量较低;MCAX-1在低温胁迫下的表达量减少,-1℃时几乎无表达,在干旱胁迫下的表达量随着胁迫时间延长逐渐达到最大值之后又迅速降低,在盐分胁迫初期的表达量无变化,但胁迫18 d时表达量明显降低。初步推测MCAX-1与桑树的抗逆性能有一定关联。     

东方山羊豆脱水蛋白基因的克隆及初步分析

 采用ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ 方法,从东方山羊豆盐诱导抑制性差减杂交ｃＤＮＡ 文库中分离到了一个脱水蛋白（GoDHN）基因。该基因ｃＤＮＡ 全长１１６９ｂｐ,开放阅读框８４３ｂｐ,编码２８１ 个氨基酸,编码的蛋白质分子量为２８．７１ｋＤａ。经实时荧光定量ＰＣＲ 分析,GoDHN 基因在东方山羊豆的茎和叶中表达量明显高于根中表达量,并且基因表达受ＡＢＡ、ＮａＣｌ和ＰＥＧ 的诱导,随着诱导时间的增加,表达量呈持续增长趋势。这些结果表明,DHN 基因在东方山羊豆的抗逆性中可能起到重要的调控作用。本研究成功构建了ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２-ＤＨＮ 植物表达载体,为下一步转基因研究奠定了基础。     

白三叶TrSAMDC1克隆及表达分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。通过分子生物学技术克隆得到一个全长为1559 bp的白三叶S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因,并命名为TrSAMDC1。对该序列进行生物信息学分析表明:TrSAMDC1开放阅读框长度为1077 bp,编码358个氨基酸;预测其编码的蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,二级结构的主要构件为无规则卷曲,三级结构为同源二聚体,可能定位于细胞质中;系统进化树表明TrSAMDC1与其他豆科植物SAMDC亲缘关系很近,在进化上高度保守。分析该基因在重金属镉(CdSO₄)、低温(4 ℃)、高温(35 ℃)、干旱(PEG-6000)和盐(NaCl)等非生物胁迫以及100 μmol·L^-1脱落酸(ABA)和1 mmol·L^-1生长素(IAA)等激素处理下的表达模式发现TrSAMDC1的表达具有组织器官和时空特异性:所有处理都能显著上调叶片的相对表达量,并且在大多数处理12 h后达到峰值。而根系表达量虽较对照有差异,但对各种处理的敏感程度显著低于叶片。推测该基因能在调节植物的生长发育以及植物应对非生物胁迫尤其是高温和重金属镉胁迫中发挥重要作用,以上结果为进一步研究该基因奠定了基础。     

干旱和钠盐胁迫对罗布麻种子萌发的影响

为探明罗布麻种子在不同水分和钠盐胁迫下的萌发特性,通过模拟盐渍化土壤溶液渗透势和主要阴离子组成,研究罗布麻种子在PEG-6000不同渗透势溶液和不同钠盐(NaCl、Na_2SO_4、NaHCO_3、复合钠盐)溶液中的萌发情况。结果表明,用PEG高渗透势(-0.05 MPa)溶液、低浓度Na_2SO_4(0.2%)和复合钠盐(0.2%~0.6%)溶液处理种子,发芽率、发芽势、发芽指数、萌发抗旱指数CK,平均发芽时间CK,盐害率为负值,发芽高峰期集中于2~4d,溶液对种子发芽具有促进和增效作用,随着溶液渗透势降低和盐浓度的增加,发芽率、发芽势、发芽指数、萌发抗旱指数逐步降低,平均发芽时间延长,盐害率增大,发芽高峰期集中于2~3d。NaCl、NaHCO_3溶液处理种子,随着浓度的增加,发芽率、发芽势、发芽指数有明显降低的趋势,平均发芽时间延迟,发芽高峰期集中于2~3d,渗透胁迫和毒害作用增强,溶液对种子萌发有明显的抑制和延缓作用。PEG、复合盐溶液处理种子,渗透势和浓度的适宜值、临界值与极限值分别为-0.09,-0.70,-1.30 MPa和0.85%,2.04%,3.22%。用相同浓度的钠盐溶液处理种子,盐害率大小总体依次为NaHCO_3NaClNa_2SO_4复合钠盐。     

NaCl和等渗PEG4000胁迫对紫花苜蓿种子发芽及生理活性的影响

为比较等渗的NaCl和PEG溶液模拟盐分和水分胁迫条件对紫花苜蓿(Medicago sativa)种子发芽过程的影响,选取5个紫花苜蓿品种分别对其种子发芽率和胚根长度进行统计。结果表明:5个品种受2种胁迫后,其发芽率和胚根长度变化趋势相似,即NaCl能显著降低紫花苜蓿种子的发芽率(P<0.05),PEG4000则影响不大;其胚根长度变化趋势为:受NaCl胁迫后胚根较粗短,PEG4000胁迫后细而长。对受2种胁迫影响较小的中苜三号发芽后其电导率、脯氨酸和叶绿素含量的测定发现,胁迫后电导率均增大,但受NaCl胁迫处理的差异极显著(P<0.01);游离脯氨酸积累均增高,其中PEG4000胁迫处理后,脯氨酸的积累极显著增高(P<0.01);中苜3号受等渗NaCl胁迫后,叶绿素含量最低,对照是其含量的2.3倍(P<0.01),受PEG4000处理后叶绿素含量有所上升,但与对照相比差异不显著。由此说明等渗胁迫条件下,盐胁迫比干旱胁迫对中苜三号的伤害更大。     

不同NaCl胁迫对苗期扁蓿豆渗透调节物质及光合生理的影响

采用盆栽法研究不同浓度NaCl(0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 mmol/L)胁迫对扁蓿豆苗期有机渗透调节物质及光合参数的影响。结果表明,相同胁迫天数下,随盐浓度的升高。扁蓿豆可溶性蛋白含量、可溶性糖含量呈降低趋势,脯氨酸含量呈升高趋势。各个观测期和浓度之间存在差异,胁迫第7 和14天,300 mmol/L浓度下可溶性蛋白含量显著低于对照(P<0.05);胁迫第7,14和21天,50~100 mmol/L浓度下,可溶性糖含量明显高于对照,但胁迫第28天,250~300 mmol/L浓度处理显著低于对照(P<0.05)。胁迫第7天,150~300 mmol/L浓度处理、胁迫第14天,200~300 mmol/L浓度处理、胁迫第21天,250~300 mmol/L浓度处理扁蓿豆脯氨酸含量均分别显著高于对照及其他处理(P<0.05)。可见,盐胁迫下,扁蓿豆产生的3 种渗透调节物质调节方式不同,盐胁迫对扁蓿豆幼苗的抑制程度与盐浓度、胁迫时间呈正比。不同的胁迫浓度和胁迫时间,扁蓿豆3 个观测期光合参数变化不尽相同。胁迫第14天,叶片净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)和胞间CO₂浓度(C_i)随盐浓度的升高呈先上升后降低的趋势。50~100 mmol/L浓度处理P_n、T_r和G_s显著高于对照,但300 mmol/L浓度处理P_n和T_r显著低于对照及其他处理(P<0.05)。胁迫第28天,4 个光合参数随盐浓度的升高而降低。叶片气孔限制值(L_s)和水分利用效率(WUE)在胁迫14 和28 d时,变化规律一致,随盐浓度的升高呈上升趋势。