南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原表位的筛选及抗原性分析

目前,我国南非Ⅱ型(SATⅡ)口蹄疫病毒(FMDV)的防控形势十分严峻,为了防止SATⅡ型FMD的跨境传入,迫切需要建立其特异的检测方法。本研究以SATⅡ型FMDV结构蛋白氨基酸序列为依据,利用分子生物学软件分析了FMDV结构蛋白VP1~VP3上可能的抗原表位,并人工合成了8条表位多肽。通过采用SATⅡ型FM-DV阳性血清进行ELISA反应,检测其反应原性;通过采用与载体蛋白偶联的合成肽免疫小鼠,测定小鼠血清中抗体效价,检测合成肽的免疫原性。结果表明,合成的8条多肽均能与SATⅡ型FMDV阳性血清结合,其中的6条多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体。本研究为利用串联表位为抗原检测SATⅡ型FMDV抗体方法的建立奠定了基础。     

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础.     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究

为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。     

通用型辅助性T细胞表位增强了猪瘟病毒合成肽抗原的免疫原性

为了探讨通用型辅助性T细胞表位对猪瘟病毒人工合成短肽抗原免疫原性的影响,本研究合成了含有猪瘟病毒E2蛋白线性中和表位的短肽B,合成了含有通用型辅助性T细胞表位的短肽Th-B。同时,为了探讨免疫刺激基序对人工合成短肽抗原免疫原性的影响,合成了含有免疫刺激序列的IS-Th-B。将上述3种合成肽与弗氏佐剂混合乳化后,免疫兔子,比较3种不同的抗原肽诱导的抗体水平,并用猪瘟弱毒对免疫兔子进行攻击,比较抗原肽的免疫保护效果。结果显示,Th-B和IS-Th-B诱导了相当的抗体水平,但显著高于抗原肽B诱导的抗体水平。Th-B和IS-Th-B免疫延迟但没有阻止兔定型热的产生,而抗原肽B免疫兔和未免疫兔一样发生了明显的定型热反应。本研究表明,免疫刺激基序对本研究中的短肽诱导的抗体应答没有产生明显影响,但通用型辅助性T细胞表位增强了短肽抗原的免疫原性。     

含有Th细胞表位的合成PCV2 ORF2 Cap多肽抗原的表达及免疫原性分析

拟测定在PCV2ORF2Cap P1多肽抗原中添加从PCV2ORF1、ORF3中筛选的Th细胞表位多肽在促进其免疫原性中的作用,以及合成表达的PCV2ORF2Cap P1多肽抗原作为疫苗抗原的可行性。采用生物信息学及分子生物学方法,筛选获得1条泛宿主新型Th细胞表位多肽和3条PCV2特异的含有Th细胞抗原表位的多肽序列,然后将这4条Th细胞多肽氨基酸序列与筛选自ORF2Cap1上的1条B细胞表位多肽序列进行串联组合,密码子优化,插入酶切位点、终止密码子,然后进行密码子适应指数和分布频率分析,预测可以实现高效表达后再进行化学合成。合成的P1多肽抗原连接到pET-30a表达载体,并转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建表达工程菌BL21(DE3)pLysS-pET-30a-P1。经IPTG诱导表达后P1可实现高效表达,SDS-PAGE鉴定表达量,Western Blot鉴定其生物活性,然后分别免疫小鼠和猪,测定小鼠免疫后的抗体水平以及猪免疫后P1合成多肽抗原对外周血淋巴细胞的刺激增殖情况。结果表明,设计合成表达的PCV2P1多肽抗原序列,密码子适应性指数为0.89,能够实现高水平表达,目的片段大小约为28.29ku,具有良好的免疫原性;MTT试验结果表明,P1多肽抗原免疫后机体内IFN-γ和IL-4的表达量明显增加,且与对照组差异显著(P0.05)。这说明P1能够诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应,为其作为疫苗用抗原的进一步研究奠定了理论基础。     

传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定

为鉴定lBDV VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份.应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性.结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1:105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合.本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础.     

奶牛PrPc结构蛋白多肽合成与免疫学特性分析

目的预测奶牛PrPc结构蛋白抗原表位,人工合成特定序列奶牛PrPc多肽用于抗体制备,同时为研究特定表位结构蛋白的功能特性提供有效手段。方法运用Goldenkey分子生物学软件对牛PrPc结构蛋白的抗原表位及其二级结构进行了分析比较,结合现有牛PrPc单克隆抗体识别表位从中筛选了一段显示表位特征的氨基酸残基序列,应用固相合成法合成15个氨基酸残基的奶牛PrPc多肽,并利用MBS法将其与KLH偶连制成免疫原,应用于动物免疫及多克隆抗体的制备,对该多抗与PrPc的反应性进行了检测。结果偶连后的牛PrPc多肽具有免疫原性,并获得了抗牛PrPc多克隆抗体。结论奶牛PrPc合成肽抗原的获得和应用,可以部分替代天然抗原,为进一步制备PrP单克隆抗体,以及Prion疾病的深入研究提供了有利条件,同时为研究特定表位结构蛋白的功能特性提供了新的途径。     

猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的研究

蛋白质抗原表位 (抗原决定簇 )是蛋白质抗原性的物质基础 ,一个蛋白质分子可带有多个不同的抗原决定簇 ,即抗原表位 (epitopes)。通常 ,抗原表位是指氨基酸序列已经清楚的抗原决定簇。蛋白质抗原表位的研究 ,对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断试剂具有较大意义。B细胞蛋白抗原表位的预测自从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来 ,已有许多参数、算法发表 [1～10],对B细胞蛋白抗原表位研究起到了巨大的推动作用。本文就猪瘟病毒(SFV)E2蛋白抗原表位的研究概况作一介绍。1猪瘟病毒E2抗…     

病毒抗原表位及其研究方法

免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个抗原分子,而仅识别抗原大分子上的一个特定部分,称为表位(epitope),又称抗原决定簇(antigenic determinant).因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区,负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合,严格说来,抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的[1].病毒抗原表位分析一直是病毒学研究的热点.近年来分子生物学方法的广泛运用,使病毒及蛋白抗原表位筛选、研究方法的不断提高.抗原表位的研究对于我们了解病毒致病的分子机理、研制合成肽疫苗将有很大帮助,如根据口蹄疫病毒结构蛋白表位研制的合成肽疫苗.在HIV的防治方面,近期研制的针对HIV gP160的表位疫苗(epitope vaccine)等都是表位研究应用的极好例子[2].目前,人们甚至能够精确到表位上1～2个氨基酸在保护性抗体诱导、致病力等方面的作用.     

猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性

为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。