大叶补血草Na+/H+ 逆向转运蛋白基因的克隆及序列分析

 根据同源序列区域设计简并引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ 及ＲＡＣＥ 方法从盐生植物大叶补血草中分离了Ｎａ^＋／Ｈ^＋逆向运输蛋白基因的ｃＤＮＡ（LgNHX1,ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＥＵ７８０４５７）。LgNHX1的ｃＤＮＡ 全长为２３９７ｂｐ,５′端非翻译区长度为５１２ｂｐ,３′端非翻译区长度为２２９ｂｐ,其中包括１２ｂｐ的ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴,中间的开放读码框为１６５６ｂｐ,编码１个５５０个氨基酸的多肽,推测分子量为６１ｋＤ。氨基酸同源性分析表明,ＬｇＮＨＸ１与北滨藜、小麦、盐角草和拟南芥液泡Ｎａ^＋／Ｈ^＋ 逆向运输蛋白的一致性分别为８２．６２％,８２．０１％,８０．６４％ 和７５．８６％。预测分析表明,ＬｇＮＨＸ１具有１１～１２个跨膜结构区域。系统发育分析表明该蛋白（ＬｇＮＨＸ１）与液泡型的Ｎａ^＋／Ｈ^＋ 逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型的Ｎａ＋／Ｈ＋ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。     

星星草PtGAPDH基因的克隆与表达分析

本试验利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)克隆技术从星星草中克隆得到抗盐碱相关基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的cDNA全长序列,其GeneBank登录号为JX411954。PtGAPDH基因开放阅读框为1014 bp,编码337个氨基酸。该氨基酸序列与高羊茅、大麦、小麦、水稻等禾本科作物具有较高的序列相似性。系统进化分析表明,PtGAPDH基因编码蛋白与单子叶植物的GAPDH具有较近的亲缘关系。Northern杂交分析显示,在一定盐碱胁迫条件下,随着处理试剂Na₂CO₃溶液浓度的增加,PtGAPDH基因在盐碱胁迫下的叶片和根部表达量都显著升高;超过最大耐受量后,PtGAPDH基因表达丰度逐渐降低。PtGAPDH基因的表达模式代表了星星草在盐碱胁迫下其自身的生理生化变化对分子水平上的基因表达丰度产生的影响趋势。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

NaCl胁迫下拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的克隆及序列分析

以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料,用TRIzol一步法RNA提取试剂盒抽提总RNA,通过RT-PCR方法和DNA序列测定,证实获得了拟南芥Na /H 逆向转运蛋白基因(AtNHX1)的cDNA克隆.该cDNA全长1 617 bp,包括538个氨基酸编码区和1个终止密码,具有多个物种Na /H 逆向转运蛋白基因的高度保守序列氨氯砒嗪脒(amiloride)的结合位点(LFFIYLLPPI).序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与原序列的同源性高达99.75%,与同科芸薹属油菜的同源性为89.00%,但与不同科植物的同源性较低,仅为60%～70%,表明该基因在进化上存在多样性,但它们都具有氨氯砒嗪脒结合位点,对Na 具有高度专一性,对植物的耐盐性起着重要作用.     

PRRSV辽宁株N蛋白基因的克隆及序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因全长cDNA,结果表明,该分离株N基因cDNA编码区长372bp,可编码123个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,核苷酸同源性分别为92.2%和27.2%,推测该辽宁分离株属于美洲型。     

唐古特白刺质膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

土壤中过多的Na⁺会导致植物产生盐害,严重影响植物的生长和发育。质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白SOS1介导植物细胞内过量的Na⁺外排,在植物抵御盐胁迫过程中起着重要的作用。唐古特白刺隶属于蒺藜科白刺属,是中国特有的盐生植物,主要生长于西北地区的荒漠或盐渍化荒漠,具有极强的抗逆能力。应用简并RT-PCR及RACE技术克隆获得唐古特白刺Na⁺/H⁺逆向转运蛋白NtSOS1基因(GenBank登录号KC292267)。序列分析显示,该 cDNA全长4 008 bp,包含3 492 bp的开放阅读框,编码分子量为127.59 kDa的蛋白质。疏水性分析预测NtSOS1基因编码蛋白N端具有11个跨膜结构域,C端具有一个面向胞质的长亲水尾部,包含保守环核苷酸结合区域、自我抑制基序及磷酸化位点等多个活性调控结构域。NtSOS1氨基酸序列与葡萄、霸王、拟南芥等植物的SOS1序列同源性较高,分别可达71.77%,68.94%,62.65%。系统发育分析表明NtSOS1基因为质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白,与液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白属于不同分支。半定量RT-PCR结果显示冷、热、盐和干旱胁迫都可以诱导NtSOS1基因的表达,同时,NtSOS1基因随着盐处理浓度增加呈现出先上升(0~300 mmol/L)后下降(400 mmol/L)的趋势。结合植物的生境特点和NtSOS1表达模式分析,该基因表达水平的升高可能在唐古特白刺适应恶劣生境的过程中发挥积极作用。本研究的开展为利用NtSOS1基因进行作物与牧草改良并深入研究唐古特白刺抗逆分子机制奠定了基础。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白（PrP）基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽（九肽）重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸（除LT200302为23个氨基酸外）的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物，采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因，序列分析结果表明，所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678bp、编码226个氨基酸的前体蛋白，其核苷酸序列的同源性为99．79％以上，发现了4个核苷酸多态性位点，无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较，与猫（AF003087，96．7％）和绵羊（96．2％）的氨基酸同源性最高。     

鹅副粘病毒F蛋白基因的克隆和序列分析

鹅副粘病毒分离株ＹＧ９７经１０日龄鸡胚增殖后纯化,提取病毒的基因组ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出与预期设计的１．７ｋｂ大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入ｐＣＥＭ＾Ｒ载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒Ｆ基因的阳性克隆。将所获得的阳性重组质粒进一步进行了序列鉴定。序列分析表明扩增的Ｆ基因片段的长度为１６９５ｂｐ,共编码５３３个氨基酸,Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸顺序为＾１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｐ－Ｆ＾１１７,与ＮＤＶ强毒株特征相符,同时也与鹅副粘病毒分离株致病性实验结果相符,同源性分析表明,与国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的核苷酸同源性为８６％,与国内外其它毒株的核苷酸同源性在８２％～８９％之间,表明该毒株相对于经典的ＮＤＶ在Ｆ片段上发生了较大的变异。     

羊朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从6只羊（3只藏绵羊和3只山羊）全血中提取基因组总DNA，用所设计引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因，并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明所克隆的羊PrP基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，为包含在单一外显子内的完整开放阅读框，其与国外报道的已知序列基本相同。所克隆的羊PrP基因含5个短而富含G-C的元件，可编码八肽Pro—His—Gly—Gly—Gly—Trp-Gly—Gln或九肽Pro—Gln／His—Gly—Gly—Gly-Gly—Trp—Gly—Gln。这些PrP基因序列相比较，其核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别在99．0％～100．0％和98．1％～100．0％之间。共发现17个碱基替换，其中6个为同义码替换、11个为异义突变。异义突变中，除SY200301～SY200303的S240P和MY200301的M112T外，其余均位于PrP氨基酸125～228的C-端球形结构区，分别为MY200301的G129S突变、MY200302的T191R突变、MY200303的G127S突变及SY200302和SY200303的H143R和R211G。6个羊PrP基因均为密码子136、154和171的PrPARQ等位基因。     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.     

鸭脂肪酸结合蛋白基因的克隆和序列多态性分析

根据鸡脂肪型脂肪酸结合蛋白（A-FABP）基因序列设计1对引物对鸭基因组进行PCR扩增，将扩增出的475bp片段进行克隆和测序，序列分析表明该基因片段包含部分外显子2、3和完整的内含子2序列，与鸡、鹅、猪的A-FABP基因分别有84％、94％和77％的同源性。在此基础上又设计3对引物利用PCR—SSCP方法对获得的序列进行多态性研究。结果引物P3在樱桃谷鸭、山麻鸭等品种中发现4处单碱基突变，分别为：241处“A～T”突变；243处的“T—C”突变；258处的“T—C”突变；299处的“C—T”突变。这些点突变共产生了3种基因型，且基因型分布在各鸭品种间有显著差异。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV-L1和FMDV-L2的RNA，用1对通用引物经RT-PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段，将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM-T Easy中，转入大肠埃希氏菌JM109，得到大量携带目的基因的质粒；经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列；利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV—L1和FMDV-L2以及作为参考毒株的A22／India／17／77进行序列分析。结果表明，核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列，氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG-βH环内，其中毒株FMDV-L1和FMDV-L2 RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异，分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

植物Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性的研究进展

植物通过外排Na+和液泡区隔化Na+来减少Na+的毒害,这一过程由Na+/H+逆向转运蛋白来完成。通过概述植物Na+/H+逆向转运蛋白的基本特征、与植物耐盐性的关系及其分子生物学研究现状,为阐明植物复杂的盐胁迫机理和利用基因工程手段提高植物耐盐性奠定了基础。     

伪狂犬病病毒立即早期180基因的克隆及序列分析简

为了研究伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）立即早期180基因（immediate early 180,IE180）及其功能,试验采用设计的特异性引物通过PCR法对IE180基因进行扩增,并成功构建了IE180克隆载体,经序列测定后,用DNAStar软件对该序列和已发表的7个PRV参考株的IE180基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比对分析。结果表明,HB-98株IE180基因编码区大小为4425 bp,编码1474个氨基酸,与GenBank中登录的参考株的IE180基因核苷酸同源性为98.4%～99.1%,氨基酸同源性为97.8%～98.4%。系统进化树分析结果表明,该毒株与毒株TNL(登录号：AF352564.2）的亲缘关系较近。     

盐生植物盐地碱蓬质膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因片段的克隆及其序列分析

为研究盐地碱蓬(Suaeda salsa)Na+长距离运输的分子机制,根据其他植物质膜Na+/H+逆向转运蛋白SOS1基因的保守序列设计一对简并引物,以盐地碱蓬根系总RNA为模板,采用RT PCR方法克隆出SOS1基因片段,以期为盐地碱蓬SOS1全长基因的克隆、表达调控等研究奠定基础。序列分析结果表明,该基因片段长度为736 bp,编码244个氨基酸;该序列与其他高等植物SOS1核苷酸序列的同源性在74%以上,氨基酸序列同源性则在61%以上。     

中国黄牛PrPc成熟蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的PrP^c蛋白基因序列，设计合成一对引物，并在2个引物的两端分别加入Bam HI和Nde Ⅰ酶切位点。以从中国黄牛肝脏中提取的基因组DNA为模板，经PCR扩增出一约640bp的目的基因片段，将此基因克隆于pET11a载体，构建了PrP^c蛋白基因重组质粒b-pET11a-PrP^c，转化DH－5α并进行序列测定。同源性分析表明：中国黄牛PrP^c成熟蛋白基因与目前国外发表牛的成熟蛋白PrP^c基因相比，有较大差异，发现了一个新的NdeⅠ酶切位点；推导的氨基酸序列有4个氨基酸差异，缺少一个8氨基酸重复区。     

驴小肽转运载体1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

小肽转运载体1(PepT1)在动物肠道小肽的摄取过程中发挥重要作用。本试验旨在研究驴(Equus asinus)PepT1(ePepT1)基因的分子克隆、序列分析和组织表达。提取驴肠道组织总RNA,PCR克隆ePepT1基因片段,测序验证并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法分别测定驴肾脏、脾脏、心脏、肝脏、肺脏、胃、十二指肠、空肠和回肠组织中ePepT1基因的相对表达量。结果表明:ePepT1开放阅读框为2 124 bp,共编码707个氨基酸残基。蛋白质理化性质预测显示,ePepT1蛋白分子质量为78.6 ku,等电点为7.52,具有11个跨膜区(TMD),且TMD 9和TMD 10之间有1个大的细胞外环;ePepT1蛋白有5个胞外N-糖基化位点,5个胞外蛋白激酶C(PKC)作用位点和3个蛋白激酶A(PKA)作用位点。组织分布研究发现,ePepT1基因在各组织均有表达,但在肠道(十二指肠、空肠和回肠)中相对表达量最高。综上所述,本研究首次克隆了ePepT1基因,研究了其组织表达规律,为进一步研究驴肠道小肽吸收提供了基础。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

新城疫病毒四平株HN蛋白基因的克隆与序列分析

新城疫病毒（ＨＤＶ）四平株在鸡胚增殖后纯化，提取ＲＮＡ，然后利用特异性引物，经ＲＴ－ＰＣＲ一次性扩增出了ＮＤＶ四平株的全长ＨＮ基因。将该ＨＮ基因插入ｐＫＳ后测序。序列分析表明，该ＨＮ基因核苷酸长度为１７４２ｂｐ，编码５７１个氨基酸，序列中有５个糖基化位点，１２个半胱氨酸残基。同源性分析表明，四平株ＨＮ基因与目前国外发表的其他ＮＤＶＨＮ基因相比，核苷酸序鲁同源性在８３．４￣８９．２％之间，推导的氨基