偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.     

灵芝漆酶基因转录Cu~(2+)诱导特性及其启动子的克隆与序列分析

以Cu2+为诱导物检测了灵芝漆酶同工酶基冈的转录特性,并对其启动子进行了克隆及序列分析.研究发现:灵芝漆酶基因在cu2+的作用下表达量出现明显差异,其中以在发酵液中添加3.0 mmol·L-1Cu2+、诱导时间为6 d时,漆酶基因的mRNA表达量最高.根据GenBank中已报道的灵芝漆酶基冈的序列信息,经PCR扩增获得了灵芝漆酶5'端长879bp的基凶特异序列,进而通过self-tbrmed adaptor PCR(SEFA-PCR) 方法,扩增得到灵芝漆酶基因起始密码子上游长832bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域除分布有TATA-box、CAAT-box及GC-box等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺式作用元什序列位点,包括4个MRE元件、4个STRE元件、11个HSE元件和5个氮因子结合位点等.     

苦荞蔗糖合酶基因克隆及序列分析

以苦荞基因组DNA为模板,根据已构建的苦荞cDNA文库中蔗糖合酶(Sucrose synthase,SuSy)的部分cDNA序列设计引物,PCR扩增SuSy基因的核心片段,结合Genomic walking技术获得SuSy基因的完整序列。生物信息学分析表明,该基因序列全长4 428bp,含有12个外显子和11个内含子,剪接位点均符合经典GU-AG法则,ORF长度为2 412bp,共编码803个氨基酸。其氨基酸序列与籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)、甜菜(Beta vulgaris)、红叶藜(Chenopodium rubrum L)和大豆(Glycine max)的相似性分别为86%、86%、85%和83%。保守结构域分析表明,SuSy含有1个GT1糖基化酶功能结构域(275~760)和4个ADP结合位点,能够催化果糖-6-磷酸和尿苷-5′-二磷酸葡萄糖形成蔗糖-6-磷酸。     

Lenzites gibbosa锰过氧化物酶1基因启动子序列的克隆

根据已克隆到的Lenzites gibbosa锰过氧化物酶1cDNA全长基因Lg-mnp1,在5’端设计了3个巢式特异性引物,利用染色体步移技术克隆得到了其上游1 568 bp的启动子序列。采用Signal Scan进行了启动子序列分析。结果表明,在起始密码子上游-92～-43 bp区域为Lg-mnp1启动子的基础启动子区;在-52 bp处有一个转录起始位点,-83 bp处有1个TATAAA-box,-119、-196 bp有2个反向CCAAT-box(ATTGG)。启动子区也存在多个顺式作用元件,包括转录因子SP-1(GGGCGG)、转录因子AP-2(CCCMNSSS)、热激元件HSE(NTTCNNGAAN)及6个推定的金属响应元件MRE(TGCRCNC)等。     

玫瑰GASA4-like基因的克隆及其序列分析

从大马士革玫瑰(Rosa damascena)中利用同源克隆结合RACE的方法首次获得了一个GASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长(GenBank登陆号FJ595792,FJ595793),并利用TAIL-PCR的方法克隆了其部分启动子序列。结果表明,玫瑰GASA4-like基因包含4个外显子,3个内含子,开放阅读框为327bp,编码108个氨基酸序列。对推导的氨基酸序列分析发现,N末端1~26个氨基酸是一信号肽序列,C末端含有12个保守的半胱氨酸残基,具有GASA基因家族共同的一些结构特征。系统进化分析表明,玫瑰GASA4-like与分生组织中表达的GASA蛋白聚为一类。启动子顺式作用调控元件分析表明,GASA4-like基因上游318bp的部分启动子含有诱导表达调控元件和一些转录因子的结合位点;最后,对GASA4-like基因可能的生物学功能进行了预测。     

油果实中查尔酮合成酶基因PsCHS的克隆表达分析及其启动子的分离

从成熟果实均一化全长cDNA文库中分离了编码CHS基因的全长cDNA序列,命名为PsCHS,根据其序列设计引物,采用Genome Walking方法从基因组DNA中分离获得PsCHS基因上游的调控序列,命名为PsCHSp,PsCHS基因全长1 442bp,其中ORF 1 176bp,编码392个氨基酸;采用APA-Walking技术,获得该基因的5ˊ端调控区,经在线软件预测,启动子序列含有典型的结构特征元件TATA-box和CAAT-box,还包含光响应元件、厌氧诱导元件、胚乳表达相关元件、MYB结合位点以及激素响应元件;RT-PCR结果显示,PsCHS基因在果实发育的前期表达量较高,花后40d表达量最高,随后开始下降,果实成熟期表达量较低。分离获得的PsCHS基因属于查尔酮合成酶基因家族成员之一,查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)是类黄酮合成途径中的一个重要酶,该基因可能对类黄酮的合成起到调控作用。     

红平菇HP1锰过氧化物酶基因克隆及染料脱色的研究

采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基添加方式,对红平菇HP1(Pleurotus djamor)进行培养,检测不同时间培养液对不同底物的氧化作用,作为锰过氧化物酶的产生及活性测定的主要依据。在含Mn2+的培养液添加底物木屑后锰过氧化物酶最大酶活为358.7 U·L-1,提取经优化筛选后的锰过氧化物酶粗酶液,对4种具有不同化学结构的染料进行了脱色试验。结果表明,对异戊二烯类番红在6 h时脱色率为82.6%。因此,显示出红平菇HP1锰过氧化物酶对番红染料脱色具有较大的应用潜力,进而对废水处理具有更好的应用前景。采用RT-PCR和RACE技术,从红平菇HP1菌株中获得编码锰过氧化物酶基因的c DNA及DNA基因的全长序列,基因组大小为1404 bp。比较该锰过氧化物酶基因的c DNA和基因组DNA的全长序列,发现该基因包含5个外显子和4个内含子。c DNA序列的全长为1199 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1095 bp,编码365个氨基酸。     

橡胶树红根病菌Fip-gpo基因的克隆及启动子分析

为预测橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum)真菌免疫调节蛋白基因的序列特点和表达模式,采用同源克隆获得Fipgpo的c DNA和DNA的全长序列。结果表明:该基因编码区全长934 bp,编码111个氨基酸残基,分子量为12.54 k D,等电点4.66,有4个ATM磷酸化位点,与赤灵芝(G.lucidum)的Fip序列相似性为91%;其启动子区域含有59 bp的内含子,除了含有TATA-box、CAAT-box基本元件外,还含有参与光应答/调控元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯应答元件、厌氧诱导作用元件、调控在胚乳中特异表达的顺式作用元件、分生组织特异激活顺式元件及生长素反应元件。推测Fip-gpo基因的表达受激素、非生物诱导、光照等的调控。     

灵芝漆酶注释基因Lacc1的生物信息学分析及其Cu2+诱导表达

为验证Lacc1基因的功能，揭示灵芝漆酶基因及其启动子结构与其转录表达的内在关系，预测了Lacc1的氨基酸序列结构及灵芝漆酶注释基因Lacc1的上游启动子区域，研究已测序的菌株——灵芝P9在Cu2+诱导条件下漆酶基因Lacc1的表达情况。Protein Blast分析结果表明，Lacc1含有3个铜氧化酶(Cu–oxidase)保守结构域，与Polyporus ciliatus漆酶lcc3–3的相似性最高，为71%，并具有高度保守的漆酶特征序列L1–L4；亚细胞位置和信号肽预测结果表明，Lacc1含有信号肽，且为胞外分泌酶；Lacc1基因上游启动子区域包含1个TATA box、3个金属响应元件(MRE)、5个氮因子结合位点(NIT2)、1个压力响应元件(STRE)；在150 μmol/L Cu2+的诱导下，Lacc1基因的表达在第6、8、10和14天分别上调了2.8、4.9、1.6和1.9倍，通过对Lacc1的启动子结构和诱导表达分析，推测灵芝漆酶注释基因Lacc1的诱导表达特性与启动子区域的金属响应元件等调控位点具有极大相关性。     

桦褐孔菌GPD基因cDNA序列和启动子的克隆与分析

利用RACE和染色体步移技术首次从桦褐孔菌中克隆得到三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)基因和启动子序列。桦褐孔菌GPD基因的cDNA序列全长1 223 bp,其中,编码区1 020 bp,共编码339个氨基酸,相对分子质量约为36.39 kDa,理论等电点为8.28。序列比对结果表明:桦褐孔菌GPD基因与鲍姆桑黄(Sanghuangporusbaumii)相似度为88%。利用染色体步移技术方法克隆得到GPD基因起始密码子上游446 bp启动子序列,分析表明在152 bp和160 bp处有2个转录起始位点,含有TATA、CAAT、CCAAT box及重要顺势作用元件LTR、O2-site、circadian、Sp1、TCCC-motif等,这将为桦褐孔菌菌株的分类鉴定、功能研究及高效表达载体的建立提供基因资源。     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

毛竹cab-PhE11基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR技术和RACE-PCR技术,从毛竹(Phyllostachys edulis)中分离了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因cDNA编码区全长,命名为cab-PhE11(GenBank登记号:EU327783)。该基因全长1154 bp,编码区cDNA全长753 bp,编码250个氨基酸。生物信息学分析表明,在cab-PhE11编码的蛋白第62~239位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,还包含1个N-糖基化位点、1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-肉豆蔻酸化位点以及1个丙氨酸富集区。序列相似性分析结果表明,cab-PhE11编码的氨基酸序列与玉米、绿豆、拟南芥、烟草等的cab基因有较高的相似性,都在80%以上,该基因属于lhcb6类基因。     

油松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,从油松(Pinus tabulae ormis)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的cDNA和DNA序列,cDNA序列全长2 157 bp,编码718个氨基酸,包含有完整的ORF,命名为TaPAL(GenBank登录号:JX280460).通过核苷酸序列多重比较表明,TaPAL基因与其他植物PAL基因高度同源,预测的蛋白序列包含与水稻、玉米PAL相同的脱氨基位点和催化活性位点.PAL系统进化树显示,TaPAL与松科类植物PAL聚类关系最近.另外,对比发现TaPAL基因组DNA序列与cDNA序列完全一样,表明该基因无内含子.     

青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析

[目的]为了进行青鱼将DNA聚合酶β基因的电子克隆与分析的试验。[方法]利用生物信息学手段克隆了青鱼将DNA聚合酶β(OlPolβ)基因全长cDNA序列,并对其启动子和编码蛋白结构进行分析。[结果]该cDNA序列的全长1 716 bp,编码含338个氨基酸残基的蛋白。OlPolβ具有14个外显子和13个内含子。OlPolβ启动子上发现了SP1等一些转录因子的潜在结合位点。[结论]OlPolβ蛋白序列与其他脊椎动物的蛋白序列具有高度一致性。     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

肚倍蚜LAC-1基因cDNA的克隆及序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)快速扩增cDNA末端(RACE)技术扩增得到肚倍蚜体内的1型漆酶基因(LAC-1).基因全长为2 327 bp包含1 773 bp的完整开放阅读框(ORF),5'和3'末端非翻译区域(UTR)分别为449 bp和105 bp.根据序列推导出该基因Eh 591个氨基酸残基构成,理论...     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的克隆和分析(英文)

[目的]获得巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[方法]以巴夫杜氏藻cDNA为模板,采用简并引物进行PCR扩增,获得533 bp特异cDNA片段。在此基础上,设计特异引物,采用5′-GenomeWalking和3′-RACE的方法,获得基因的5′-端DNA序列和3′-端cDNA序列,进而获得β-肌动蛋白基因cDNA全长序列。[结果]获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因的特异cDNA片段、5′-端DNA和3′-端cDNA片段。经拼接后,扩增出全长cDNA。β-肌动蛋白基因cDNA全长1 754 bp,包括1 137 bp的开放读码框和617 bp的3′-非翻译区序列。氨基酸序列相似性分析发现,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白氨基酸序列与杜氏盐藻、莱茵衣藻等的同源性较高。系统发育分析表明,巴夫杜氏藻β-肌动蛋白与杜氏盐藻的相似性最高。[结论]首次获得了巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因cDNA全长序列并发现巴夫杜氏藻β-肌动蛋白基因非常保守。     

大麦幼穗MLOC-14401基因编码区的同源克隆和序列分析

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列。【结果】MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82%,位于大麦3H染色体的609 892 778~609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点。所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间。【结论】MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用。