牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ.参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因.选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析.结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460 bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%.由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道.     

两株牛源荚膜A群脂多糖3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

用北京、山东两奶牛场疑似牛出败的病死牛组织感染小鼠,小鼠死亡后取组织染色镜检、接种血清TSA和麦康凯培养基,分离到2株疑似多杀性巴氏杆菌,命名为Pm1和Pm2。经细菌培养特性及形态检验、多杀性巴氏杆菌种特异性PCR、荚膜A、B血清群特异性PCR、脂多糖基因分型PCR、荚膜A群透明脂酸抑制试验鉴定其为荚膜血清A群、脂多糖3型多杀性巴氏杆菌。将Pm1和Pm2回归小鼠证明有强毒力。本试验为国内荚膜A群多杀性巴氏杆菌的流行病学研究增添了一些新数据。     

4株荚膜A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2011年7月，从高邮某养殖户两次送检病死麻鸭的肝脏、心脏中分离出4株细菌，对纯化的菌株进行形态学和培养特性的观察、生化反应、血清型PCR鉴定及16SrDNA基因序列分析，确定4株分离茵均为荚膜A型多杀性鸭巴氏杆菌，鸭群所患疾病为该致病菌引起的鸭霍乱。4株分离茵的药敏结果表明，其对氯霉素、强力霉素、萘啶酸等药物多重耐药，而对左氟沙星等药物敏感。     

一株猪A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

对东营某猪场送检猪病料进行细菌分离,对分离菌进行形态学观察、生化试验、药敏试验、致病性试验和PCR鉴定.结果成功分离到一株血清A型多杀性巴氏杆菌,该菌的分离鉴定为自家灭活菌苗的制备提供了候选菌株.     

一株牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

对重庆市某牛场运输后的牛的鼻拭子进行病原分离,对其进行培养形态及染色、动物致病性情况观察及16SrRNA序列分析,初步鉴定为牛多杀性巴氏杆菌(PM)。利用PM种特异性引物及荚膜血清特异性引物进行PCR扩增,均得到目的基因条带。由此确定分离菌株为牛荚膜A型巴氏杆菌。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

一株鸡源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离鉴定及耐药性分析

从疑似禽霍乱病死鸡中分离一株细菌,采用16SrRNA方法鉴定为多杀性巴氏杆菌,PCR方法分析其血清型为A型,对其进行耐药性分析,结果显示分离株对氨苄青霉素、头孢噻肟、恩诺沙星、多粘菌素敏感,对青霉素、链霉素、四环素、氟苯尼考高度耐受.本研究结果为鸡源多杀性巴氏杆菌的防治提供参考.     

犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

新疆石河子6个规模化奶牛场相继出现出生1～9周龄的犊牛发生体温升高、呼吸困难以肺部感染为主,部分犊牛发生腹泻的疾病,造成90余头犊牛因肺炎死亡.从其中2个发病牛场死亡犊牛采集痛料,经涂片镜检、细菌分离培养、生化鉴定及动物试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm142-x-3、Pm142-x-4、Pm149-xby、Pm149-x,参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtl和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD序列,合成引物,进行PCR扩增.选取Pm149-x-3的目标PCR产物进行序列测定并分析比较,结果表明,Pm149-x-3的kmtl基因片段全长为460 bp,与GenBank中各血清型kmtl基因核苷酸同源性为99.4%;荚膜血清型A菌株特异性基因核苷酸同源性为97%;而扩增其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因均未获得目的条带.由此确认,分离的4株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型.药敏试验表明分离的多杀性巴氏杆菌对氧氟沙星、庆大霉素敏感.     

雁鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为鉴定一株从雁鸭脏器内分离到的革兰氏阴性细菌,本研究对该菌进行分离培养、细菌16S rRNA序列比对、动物试验和药物敏感性试验。结果表明该分离菌与多杀性巴氏杆菌(P.mutocida)(AF224297)同源性达99.88%,毒力强,能够致死家兔、小鼠和鸡,对氧氟沙星等药物敏感。分离菌的荚膜抗原血清型特异性基因PCR产物与荚膜血清A型P.mutocida hyaD-hyaC基因同源性达99.9%,确定该菌株为荚膜血清A型P.mutocida。本研究首次从雁鸭体内分离到A型P.mutocida。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌培养特性和免疫原性的研究

为了确定牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pm)的培养特性,本研究采用脑心浸液(BHI)培养基分别于静止、75r/min、250r/min3种培养转速对Pm进行培养,并与加血BHI进行比较,通过绘制生长曲线和小鼠毒力试验对Pm的培养基和培养转速条件进行优化,确定最佳培养条件为,以37℃,0.1%全血脑心浸汤(MB-HI)培养基,75r/min培养16h。将培养的A型Pm灭活后,免疫SPF小鼠,同时设立B型Pm灭活苗免疫组,攻A型Pm后的结果显示,A型灭活菌的保护率为100%,而B型灭活苗免疫组全部死亡。本研究通过对牛源A型Pm培养特性和免疫原性的研究,为新型牛出血性败血症灭活疫苗的研制提供了实验依据。     

PRRSV感染猪体内多杀性巴氏杆菌的分离与血清型鉴定

应用常规方法和PCR技术,对来自安徽肥西、庐江、肥东、定远、桐城5个地区猪场检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性的肺脏进行多杀性巴氏杆菌(Pm)的分离及其血清型鉴定。结果显示,49份病料中分离鉴定出7株Pm,且均属于A型,分离率为14.3%,高于其他细菌(副猪嗜血杆菌、猪链球菌)的检出率。表明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)患猪继发或混合感染Pm的比率较高,而且A型Pm是安徽省感染猪群中的主要血清型。     

新疆石河子规模化牛场多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了确定石河子地区某规模化牛场出现呼吸困难、咳嗽、病牛消瘦甚至死亡的病因,本研究以病牛病变组织为研究对象,采用常规细菌分离鉴定和细菌16SrRNA序列分析来鉴定菌种,以及多杀性巴氏杆菌种特异性基因Kmt-1和各个荚膜血清型特异性基因(hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD)PCR扩增来确定细菌的血清型,同时应用纸片扩散法对分离细菌进行药物敏感性试验和小鼠感染试验。结果表明,从病变的肺组织中分离到1株菌落为灰白色、露珠状、不溶血,染色为革兰阴性球杆状细菌,生化鉴定结果符合巴氏杆菌特征,同时16SrRNA序列分析与NCBI上已公布的多杀性巴氏杆菌16SrRNA序列同源性在99%以上;对多杀性巴氏杆菌特异性基因Kmt-1以及各血清型特异性基因PCR扩增只扩增到Kmt-1和hyaD-hyaC特异性基因片段;分离菌株对链霉素、庆大霉素、卡那霉素耐药,对其他30种药物敏感,同时感染小鼠全部死亡。结果显示从病牛体内分离到1株毒力较强的血清A型多杀性巴氏杆菌。     

鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定临床疑似鸭多杀性巴氏杆菌感染肉鸭的病原菌,本试验通过细菌分离培养、菌体形态观察、细菌生化鉴定、16S rRNA基因测序分析、细菌种特异性鉴定、荚膜分型鉴定和动物回归试验进行鉴定,并通过药敏试验和耐药基因检测进行耐药性分析。结果显示,从患病鸭肝脏组织分离到的细菌在鲜血琼脂培养基中呈现表面光滑凸起、灰白色菌落,为革兰氏阴性短小杆菌,瑞氏染色呈两极浓染;生化鉴定结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖和甘露醇,硫化氢、氧化酶和吲哚等试验阳性;16S rRNA基因序列系统进化树分析显示,该分离菌与多杀性巴氏杆菌聚为一支,同源性 > 99%;细菌种特异性鉴定结果与多杀性巴氏杆菌相符;荚膜分型鉴定结果仅扩增到约为1 050 bp的目的基因片段,与荚膜血清A型相符;动物回归试验显示,该分离菌有较强的致病性;药敏试验结果显示,该分离菌对羧苄西林、氨苄西林、复方新诺明和四环素等12种药物耐药;经耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带Sul1、Sul3、tet（X）和Intl1 4种耐药基因,与药敏表型相符。本试验成功分离到1株鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌,为鸭多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考依据。     

2017年我国猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解2017年我国猪源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）的流行情况及其耐药情况,利用细菌分离培养和PCR方法分离鉴定Pm,对其荚膜血清型、地区分布和感染方式进行调查,并采用纸片法测定分离株对20种抗菌药物的敏感性。结果显示,从全国6288份临床病料中分离并鉴定出236株Pm,总分离率为3.75%。随机选取55株进行血清型分型,其中A型25株,D型27株,F型1株,未定型2株;分离率最高的省份为广东省（4.97%）,其次是河南省（3.69%）和湖北省（3.25%）;感染模式中,Pm单纯感染占比42.80%,混合感染占比57.2%,最常与链球菌和副猪嗜血杆菌共感染,比例分别为28.81%和12.29%。耐药性试验显示,Pm对强力霉素的耐药率高达83.64%,对卡那霉素、庆大霉素、链霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物的耐药率为43.64%～52.73%,对多粘菌素B和氧氟沙星最敏感（耐药率均为1.82%）。本研究表明我国猪群中Pm流行的主要血清型仍然是A型和D型,临床上Pm与其他细菌发生混合感染的情况普遍存在,并且对多种抗生素产生了耐药性。     

雏鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和荚膜PCR分型

本研究从河南某肉鸭养殖场感染鸭肝炎病毒的10日龄病死鸭肝脏中分离到一株致病菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应、致病性回归试验和SPF鸡攻毒试验,结合多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm) kmt1种特异性基因检测方法进行鉴定,并通过16S rRNA序列测定进行同源性分析.结果显示该分离株为Pm,命名为Pm-Y.致病性回归试验表明低浓度的Pm-Y只引起部分10日龄雏鸭发病死亡.SPF鸡攻毒试验显示,Pm-Y与国内标准强毒株C48-1的致病力相近,16S rRNA序列系统发育树分析表明Pm-Y与Pm多杀亚种和杀禽亚种亲缘关系最近.参考荚膜血清特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD合成引物,扩增荚膜血清型特异性基因,对Pm-Y进行荚膜分型鉴定为A型Pm.本研究是国内首例从感染鸭肝炎病毒10日龄雏鸭肝脏中分离到Pm的报道.     

10日龄肉鸭混合感染新型鸭肝炎病毒和多杀性巴氏杆菌的病原学研究

对1例疑似鸭肝炎病毒和多杀性巴氏杆菌混合感染的10日龄肉鸭采用常规的病毒、细菌鉴定方法和RT-PCR、PCR方法分别进行病毒、细菌的分离与鉴定。病毒鉴定为新型鸭肝炎病毒,细菌鉴定为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌多杀亚种。细菌对SPF鸡的毒力试验结果显示,分离的巴氏杆菌与强毒标准株C48-1毒力相近,为强毒株。细菌对10日龄肉鸭的致病性回归试验结果表明,一定数量的该株巴氏杆菌可导致10日龄雏鸭的感染死亡。结果表明,该批肉鸭为新型鸭肝炎病毒和A型多杀性巴氏杆菌混合感染。这是国内首例从感染鸭肝炎病毒10日龄雏鸭肝脏中分离到多杀性巴氏杆菌。     

羊源D型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为了确定石河子地区规模化羊场出现呼吸道症状死亡羊的细菌性病原,采用常规细菌分离鉴定方法、细菌16SrRNA序列分析以及多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt,从病变肺组织分离鉴定细菌,利用5个荚膜血清型特异性基因确定其血清型,扩增分离株的16个毒力相关基因,分析分离菌致病性和对常用抗菌药物的耐药性。结果表明,从病羊的病变肺组织中分离鉴定到一株血清D型多杀性巴氏杆菌,具有较强的致病性;携带8个毒力相关基因,其片段序列与NCBI上己公布的多杀性巴氏杆菌参考株同源性在99%以上;分离株对青霉素、林可霉素、庆大霉素、复方新诺明耐药,对其他23种药物敏感。     

禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定及基因分型

为确定疑似禽霍乱病例病原种类及其病原基因型,本研究采用细菌分离技术对病原菌进行实验室分离培养,应用传统方法和分子生物学方法对分离细菌进行鉴定,并应用PCR扩增和基因序列分析对分离细菌进行基因分型。结果显示,分离菌具有多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）典型培养特征,菌落形态和菌体染色特征、生理生化特性均与多杀性巴氏杆菌相符;PCR扩增到457 bp的基因片段。采用5对分型引物对分离菌进行基因分型显示,仅有A型引物扩增到大小1 050 bp的目的基因片段,序列分析也显示分离菌荚膜基因与A型多杀性巴氏杆菌参考菌株荚膜特异性基因同源性高达97.6%~100.0%,系统进化与A型多杀性巴氏杆菌处于同一进化分支。结果表明,疑似禽霍乱病例病原为A型多杀性巴氏杆菌,本研究结果将为禽霍乱的防控提供参考资料。