橡胶树乳管特异性启动子连接HbHMGR1基因的易碎胚性愈伤组织转化

[目的]以3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1基因(HbHMGR1)乳管表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,获得抗性转基因材料,为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础.[方法]用根癌农杆菌EHA105介导表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树品种热研8-79花药易碎胚性愈伤组织,经卡那霉素筛选数月后,对抗性愈伤组织进行GUS染色和分子检测.[结果]经过对根癌农杆菌侵染的易碎愈伤组织进行4~6个月筛选,得到5个GUS检测呈阳性的抗性愈伤组织系;取其中的2号和11号抗性愈伤组织系进行PCR鉴定,均能扩增出与阳性对照相同的特异片段,uidA、NPTⅡ和PHEV2.1-HbHMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592bp.2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定,发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带,而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带,包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列,其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列.[结论]将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中,可获得一个含35S-NPTⅡ-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系.     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

农杆菌介导的AtMYB118基因转化橡胶树易碎胚性愈伤组织体系优化

[目的]采用正交设计L25(56)优化农杆菌介导的AtMYB118基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织的遗传转化体系,为橡胶树品种遗传改良提供参考.[方法]以75.0 mg/L卡那霉素筛选经过转化的愈伤组织;采用GUS瞬时表达检测方法评价6个因素即预培养时间、农杆菌菌液浓度(OD600)、乙酰丁香酮(AS)浓度、侵染时间、共培养温度和共培养时间对遗传转化的影响.[结果]6个因素显著影响橡胶树长期培养的易碎胚性愈伤组织的转化频率,易碎胚性愈伤组织遗传转化优化条件为:预培养0d,菌液OD600为0.7,侵染时间7 min,共培养时间5d,AS 200 μmol/L,共培养温度25℃.在此优化条件下可获得最高转化频率.经过4~6个月的筛选,获得17个GUS染色阳性的易碎愈伤组织系.经PCR和反转录PCR分析转化愈伤组织,进一步证实uidA、nptⅡ、AtMYB118基因已被整合到愈伤组织基因组中并表达.培养获得1539个胚状体,其中164个为转基因胚状体,转化频率为10.6%;最终获得4株转AtMYB118基因植株.[结论]优化获得可行有效的橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化体系,可为其品种遗传改良提供技术支持.     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

矮牵牛PhDFR基因和抗除草剂Bar基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化研究

[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。     

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。     

农杆菌介导CBFl基因转化安祖花的研究

[目的]为获得耐低温安祖花奠定基础.[方法]利用农杆菌介导CBFl基因侵染安祖花,并研究不同浓度乙酰丁香酮(AS)和侵染时问对转化后安祖花抗性愈伤组织的存活率和抗性芽分化率的影响.[结果]以重组质粒pBI121-CBFl为模板,利用CBFl cDNA全长的引物序列进行PCR扩增,获得约650 bp的片段,表明重组质粒构建成功.在抗性培养基上筛选12周后,部分愈伤组织褐化死亡.用100 μmol/L AS作为诱导物质时,抗性愈伤组织存活率和抗性芽的分化率较高.农杆茵侵染时间对转化后愈伤组织存活率和抗性芽分化率有一定影响.[结论]当AS浓度为100 μmol/L、侵染时间为10min时,抗性愈伤组织的存活率及分化率最高,分别为48.6%和11.46%.     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.     

水稻线粒体nad5基因超表达载体的构建和遗传转化

以TRIzol法提取的水稻幼苗总RNA反转录的cDNA为模板,以重组PCR技术扩增得到nad5的ORF,构建含有线粒体信号肽Rf1b5’的nad5双元超表达载体pCAMBIA1305.1::35S::Rf1b5’::nad5,以农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻遗传转化。克隆得到的水稻nad5基因大小为2 013 bp,构建了携带线粒体信号肽Rf1b5’的nad5植物表达载体,并成功获得了超表达nad5基因的阳性植株。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

水稻OsOle1基因的克隆及其遗传转化

[目的]克隆水稻OsOle1基因并对其进行遗传转化。[方法]通过RT-PCR方法对OsOle1基因进行克隆,将克隆出的OsOle1基因连接到pCAMBIA1300上构建其超表达载体,并通过农杆菌介导对水稻愈伤进行了遗传转化。[结果]克隆出的OsOle1基因全长498bp,编码165个氨基酸,成功构建了其超表达载体Ub：：OsOe1-GUS,最终得到了转基因株系。[结论]为OsOle1基因的功能研究奠定了基础。     

水稻OsOle1基因的克隆及其遗传转化

[目的]克隆水稻OsOle1基因并对其进行遗传转化。[方法]通过RT-PCR方法对OsOle1基因进行克隆,将克隆出的OsOle1基因连接到pCAMBIA 1300上构建其超表达载体,并通过农杆菌介导对水稻愈伤进行了遗传转化。[结果]克隆出的OsOle1基因全长498bp,编码165个氨基酸,成功构建了其超表达载体Ub：：OsOe1-GUS,最终得到了转基因株系。[结论]为OsOle1基因的功能研究奠定了基础。     

本氏烟抗细胞凋亡基因NbDAD1克隆及遗传转化研究(英文)

[目的]克隆本氏烟的抗细胞凋亡基因 NbDAD1,并对该基因进行遗传转化研究。[方法]通过 RT-PCR 技术分离本氏烟 NbDAD1 基因,构建基因超表达载体,以获得转入NbDAD1基因和携带HAtag标签的NbDAD1基因抗性植株。[结果]试验克隆出了全长351 bp的本氏烟NbDAD1基因;成功构建了重组质粒pCAMBIA1301-NbDAD1和pCAMBIA1301-NbDAD1HAtag;共获得3个基因型50株T0代抗Hyg本氏烟植株,其中23株检测 PCR 呈阳性。[结论]该试验为研究 NbDAD1 基因在本氏烟中的具体功能及深入探讨 DAD1 蛋白在植物细胞程序性死亡中可能的作用机制奠定了基础。     

本氏烟抗细胞凋亡基因NbDAD1克隆及遗传转化研究

[目的]克隆本氏烟的抗细胞凋亡基因NbDAD1,并对该基因进行遗传转化研究。[方法]通过RT-PCR技术分离本氏烟NbDAD1基因,构建基因超表达载体,以获得转入NbDAD1基因和携带HAtag标签的NbDAD1基因抗性植株。[结果]试验克隆出了全长351 bp的本氏烟NbDAD1基因;成功构建了重组质粒pCAMBIA1301-NbDAD1和pCAMBIA1301-NbDAD1HAtag;共获得3个基因型50株T0代抗Hyg本氏烟植株,其中23株检测PCR呈阳性。[结论]该试验为研究NbDAD1基因在本氏烟中的具体功能及深入探讨DAD1蛋白在植物细胞程序性死亡中可能的作用机制奠定了基础。     

虾青素合成关键酶基因bkt和CrtR-B双价植物表达载体的构建及对花生的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)是虾青素的生物合成途径中的两个关键酶。采用LaTaqDNA聚合酶用PCR的方法分别从pET-28a(+)-bkt,pET-28a(+)-CrtR中扩增得到bkt和CrtR-B基因,用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点,再用CrtR-B基因替换pCAMBIA1301中的另一个GUS基因,形成CrtR-B基因表达盒,最终获得带有抗性基因的双价植物表达载体pCAMBIA1301-bkt-CrtR。通过农杆菌EHA105介导将其转入花生(花育23),获得了经卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,花生基因组中含有这两个基因。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

［目的］研究MS2基因的功能。［方法］采用RT-PCR克隆棉花花粉育性（MS2）基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chinase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。［结果］成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。［结论］该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。     

核糖体失活蛋白(RIP)基因克隆及其表达载体的构建

以按玉米RIP基因(M83927)序列设计合成的特异性引物,用提取的玉米基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段,测定并克隆玉米的RIP基因。序列分析表明,它们的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的CRIP(M83927)的同源性分别为99.90%和100%。RIP与植物表达载体pCAMBIA2301相连构建成为带有35S启动子和polyA终止子的植物表达载体p2301-RIP。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中Os-WRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了该基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinG-FP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了OsWRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBinGFP-OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。