养殖鳗鲡拟指环虫病的研究与控制现状

拟指环虫在鳗鲡的寄生呈全球性分布,已成为日本鳗鲡、欧洲鳗鲡、美洲鳗鲡、澳洲鳗鲡等养殖鳗鲡的主要寄生虫之一,虫体大量寄生及驱虫药物大量使用导致鱼体应激,进而引发其他疾病,给鳗鱼养殖业带来巨大经济损失。文章通过综述鳗鲡寄生拟指环虫的分类地位、主要种类及感染宿主,在鳗鲡养殖过程中的流行趋势及虫体寄生宿主出现的主要症状和病理变化,以及驱虫药物的驱虫效果研究和拟指环虫病防控技术现状,发现在鳗鲡拟指环虫病有效防控方面仍然困难重重,尤其缺乏特效的防治药物,药物使用应激性产卵后导致二次感染的现象普遍存在,且拟指环虫对美洲鳗鲡、欧洲鳗鲡等的特异性选择机制及药物使用后耐药性产生的机制尚不清楚,虫体体外培养技术也未成熟,因此亟待研究拟指环虫离体培养模型,建立拟指环虫人工感染和传代系统,开展鳗鲡拟指环虫低毒性、低残留等安全控制药物的研制及口服驱虫药物的研发,并基于水体温度、pH、水流速、生物天敌等进一步加强拟指环虫生态防控技术和免疫防控技术研究,为鳗鲡产业的可持续健康发展提供有力技术保障。     

鳗虫净治疗美洲鳗拟指环虫病试验

美洲鳗在养殖生产过程中，尤其在苗种生长阶段极易受拟指环虫侵袭。我们在治疗此类疾病进行药物筛选过程中，发现鳗虫净是一种治疗美洲鳗拟指环虫病的特效良药，其药效和价格均优于敌百虫合剂和甲苯咪唑。     

吡喹酮和克螨特对寄生欧洲鳗鲡的拟指环虫的效果

试验结果表明,吡喹酮和克螨特是寄生在欧洲鳗鲡上的拟指环虫的有效驱除药物.新洁尔灭作为吡喹酮和克螨特复配的助溶剂,对配方的除虫效果无显著影响.驱除拟指环虫的最佳配方为吡喹酮∶克螨特∶新洁尔灭=2∶1∶1,以酒精溶解的溶液制剂能有效驱除欧洲鳗鲡寄生的拟指环虫.     

养殖欧洲鳗鲡拟指环虫病的防治

在欧洲鳗鲡养殖过程中,拟指环虫是危害最严重的寄生虫之一,从白仔期到成鳗期均会受到拟指环虫的感染。近年来,许多养鳗场欧洲鳗鲡的拟指环虫病频繁发生,危害越来越严重,治疗越来越难,给养鳗业者造成很大的经济损失。现将在生产实践中总结的几条较有效的防治方法介绍如下：     

复方甲苯咪唑对拟指环虫的杀灭效果和对欧洲鳗的毒性

２６℃,２８℃,３０℃水温下复方甲苯咪唑对欧洲鳗的毒性试验表明,随水温升高、药浴时间延长、药物浓度提高,甲苯咪唑对欧洲鳗的毒性加强;复方甲苯咪唑、甲苯咪唑、左旋咪唑对拟拟环虫的杀灭率表明,甲苯咪唑对拟指环虫具强杀灭能力,左旋咪唑对拟指环虫无杀灭能力,可用甲苯咪唑替代复方甲苯咪唑。     

鲢指环虫病病原小鞘指环虫的存活时间

对小鞘指环虫纤毛幼虫和成虫的存活时间进行了研究。结果表明,该虫的纤毛幼虫在２２℃时一般可在曝气自来水中存活０．５～７７．７ｈ,在１２℃可达５．０～３１０．５ｈ;将成虫置于曝气自来水中,在４,１２,２０和２８℃的最长存活时间分别是３０５．７,２８３．６,１０１．２和７８．８ｈ。在１５～２４℃的水温条件下,该虫感染宿主后大约可存活１个月。     

复方中草药防治观赏鱼指环虫病研究

[目的]探索复方中草药对红鲫指环虫病的治疗效果。[方法]用马尾松叶、辣蓼、苦楝、乌桕叶、雷丸等制备的不同浓度（5、8、10g/L）的复方中草药合剂浸泡感染指环虫的红鲫,比较不同处理的杀虫效果。[结果]5 g/L中草药合剂对指环虫的杀灭效果不太理想;8g/L中草药合剂对指环虫的杀灭效果最好,6 h内杀虫率为20%～50%,24 h杀虫率达100%,且对红鲫无毒害作用;10 g/L中草药合剂对指环虫也具有一定的杀灭效果,但其对红鲫具有毒害作用。[结论]8 g/L中草药合剂可有效杀灭红鲫指环虫。     

8种植物杀灭鱼类指环虫的活性部位研究

【目的】确定曼陀罗、博落回、小果博落回、银杏、蛇床子、鸦胆子、木通和槟榔等8种植物杀灭鱼类指环虫的活性部位。【方法】制备感染指环虫的金鱼模型。分别用石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、正丁醇和水提取曼陀罗等8种植物的有效成分,并检测其杀灭指环虫的生物活性,根据其杀虫效果来确定8种植物各自的活性部位。【结果】曼陀罗、博落回、蛇床子和银杏外种皮的氯仿提取物,鸦胆子和小果博落回的石油醚提取物及木通和槟榔的正丁醇提取物对金鱼指环虫的杀灭活性较强。【结论】曼陀罗、博落回、蛇床子和银杏外种皮杀灭指环虫的活性部位为氯仿提取物;鸦胆子和小果博落回的活性部位为石油醚提取物;木通和槟榔的活性部位为正丁醇提取物。     

金鱼顽固性指环虫和三代虫病的防治

据饲养经验介绍了金鱼养殖过程中最常见、又最麻烦的指环虫、三代虫寄生虫性疾病的病原体生物学特性及AEZ灭虫王的特效防治方法。     

正交设计优化稻瘟病菌SSR-PCR反应体系

[目的]筛选最佳的稻瘟菌SSR—PCR反应体系。[方法]利用正交设计对稻瘟菌SSR—PCR反应体系中的5个因素（TaqDNA聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP、引物）在4个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平并进行退火温度梯度试验筛选最佳的退火温度。[结果]稻瘟菌SSR-PCR反应的最佳体系为：反应总体积为20μl,raqDNA聚合酶1．0U,Mg^2＋ 2．0mmol／L,DNA100ng,dNTP50la,mol／L,引物（ms355～356）0．4μmol/L,最佳退火温度为58．5℃。在此体系下可从稻瘟菌材料基因组DNA中扩增出300bp左右清晰的目的条带,说明该体系稳定,适用于稻瘟菌基因组DNA的SSR标记。[结论]该研究为稻瘟菌的分子标记、遗传多样性研究和分子育种奠定了基础。     

小豆SSR-PCR反应条件的优化

笔者对小豆SSR-PCR扩增体系的反应条件进行了优化,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度、Taq聚合酶浓度对PCR扩增结果的影响。结果表明:在10 μL的PCR反应体系中,Mg2+的最适浓度为2 mmol/L,dNTP最适浓度为0．25 mmool/L,反应体系中Taq聚合酶宜加入1 U,引物的最适浓度为 0．15 mmol/L,DNA模板加入量为20 ng。     

鳗鲡肠道产蛋白酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

采用酪蛋白平板透明圈法,结合以鱼粉为底物的蛋白酶活力测定法,从欧洲鳗鲡肠道中分离筛选出1株高产蛋白酶的菌株MJ15。通过形态学观察、Biolog鉴定以及16SrRNA基因序列分析,该菌株鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis。对菌株MJ15所产蛋白酶性质进行初步分析,结果显示,其最适作用温度和pH值分别为40℃和5.0,酶的热稳定性以及碱稳定性较差;K~+、Na~+、Cu~(2+)、Fe~(2+)对蛋白酶有激活作用,但Zn~(2+)、Pepstatin A对该酶有抑制作用;该酶的Km值和Vmax值分别为8.77 mg·mL~(-1)和53.48μg·min~(-1)·mL~(-1)。     

采用微卫星标记技术研究四川省马铃薯晚疫病菌种群遗传多样性

从2006年到2007年在四川省8个马铃薯主产区采集的晚疫病样本中单孢分离得到91个晚疫病菌菌株。引用国际上通行的两个微卫星标记Pi4B和Pi4G,对这91个菌株的基因型进行遗传多样性分析,鉴定出8个SSR基因型:D-03、D-05、D-06、F-01、F-03、F-06、G-02和H-01;占优势基因型的为F-01和F-06,在群体中所占的比例分别为39.56%和15.38%。不同地区的菌株SSR基因型多样性也不相同。     

欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因序列分析

对克隆的欧鳗源嗜水气单胞菌β一溶血素基因AHL316HEM进行序列和结构分析表明，AHL316HEM基因读码框架全长为1482bp，编码长度为493个氨基酸的蛋白，分子量为54．2kD，等电点为5．625，读码框架内有一个EcoRI酶切位点。AHL316HEM从起始位点至第23个氨基酸残基形成一明显疏水区，可能构成信号肽，其抗原位点大部分都在亲水区，不具穿膜性。同源性分析表明，AHL316HEM基因编码的氨基酸序列与已报道的嗜水气单胞菌溶血素基因(accessionNo．BAA83088)的同源率为98％，与斑点气单胞菌溶血素基因(accessionNo．U40711)、温和气单胞菌溶血素基因(accessionNo．AF443393)的同源串分别为84％和72％，与霍乱弧菌溶血素基因(accessionNo．AF540655)、副溶血弧菌溶血素基因(accessionNo．VIBTRH2A)、金黄葡萄球菌β—溶血素基因(accessionNo．S72497)的同源性分别为7％、5％和4％。这一结果提示，气单胞菌属内各菌种的溶血素基因可能有共同的起源。     

鳗鲡溃烂病病原的分离与鉴定

从广东深圳患溃烂病的病鳗肝脏分离到一株致病性细菌AnGS020501。该菌的主要特征为:革兰氏阴性,端生鞭毛,TCBS平板上生长,氧化酶阳性,葡萄糖发酵型,对弧菌抑制剂O/129(50μg/片)敏感。通过常规细菌学方法和应用ATB细菌自动鉴定仪,鉴定该菌为创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。人工感染实验结果证明,该菌是鳗鲡溃烂病的病原菌,对鳗鲡、罗非鱼、鲫、斜带石斑鱼和小鼠的半数致死量(LD50)分别为2.69×105、1.64×105、4.23×105、6.1×106、1.56×106CFU/g。该菌胞外产物对鳗鲡的LD50为1.02μg蛋白/g鱼体重。药敏试验结果表明:诺氟沙星、庆大霉素、四环素、多西环素及利福平等对该菌有显著的抑制作用。     

优球蛋白法纯化欧鳗免疫球蛋白

采用优球蛋白法与饱和硫酸铵分步盐析法纯化欧洲鳗鲡血清免疫球蛋白(Ig),利用SDSPAGE分析其纯度.试验结果显示:优球蛋白法纯化的欧鳗血清免疫球蛋白出现清晰2条带,纯度高于饱和硫酸铵分步纯化法;ELISA分析优球蛋白法纯化的欧鳗血清效价高于饱和硫酸铵纯化结果;Western-blot结果亦显示纯化的优球蛋白具有抗体免疫学活性.     

欧洲鳗鲡免疫球蛋白轻链基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR技术克隆欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)Ig轻链基因cDNA全长序列,命名为AaIgL,其全长为1 016bp,开放阅读框为714bp,编码238个氨基酸。将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明新增的27ku蛋白条带与预期值相符,且与兔抗欧洲鳗鲡IgM血清发生特异性显色反应,证实了AaIgL基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;实时荧光定量PCR检测结果发现:AaIgL在欧洲鳗鲡各组织中均有表达,其中脾脏的表达量最高,肾脏和心脏中也有较高的表达水平,而肝脏、肌肉、鳃以及肠中的表达量较低;欧洲鳗鲡经山羊IgG肌肉注射后脾脏和肾脏的AaIgL表达水平明显上升,其峰值分别为第7天和第14天,AaIgL在脾脏的表达量显著高于肾脏,但是第21天后均恢复至正常水平。以上结果表明,AaIgL在欧洲鳗鲡机体免疫防御中发挥重要作用,脾脏是AaIgL基因的主要表达器官。     

欧鳗嗜水气单胞菌的分离、鉴定和特性分析

2000年夏季福建地区许多鳗场养殖的欧洲鳗暴发以脱粘、败血为主要症状的疫病，从不同来源的濒死鳗鱼体内分离到4株细菌。细菌的形态学、生化分析和补充试验结果符合嗜水气单胞菌的各项指标，PCR检测4株分离菌均扩增出特异性的气溶素基因（aerA)209bp片段及胆酶基因（Lip)760bp片段，进一步证实这些分离菌为嗜水气单胞菌并存在毒力基因。人工造病实验结果表明，分离株M00081205①的菌体纯培养物和胞外产物对昆明小白鼠和欧洲鳗分别具有中等和高度的致病力，初步证实嗜水气单胞菌是欧鳗夏季爆发性疫病的病原之一。     

鳗鲡肠道中嗜水气单胞菌的拮抗菌筛选

从鳗鲡肠道中分离到643株细菌,用点种法筛选出65株病原性嗜水气单胞菌的拮抗菌,研究拮抗效果最好的14株拮抗菌的抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用.研究结果显示：NAC琼脂培养基筛选的2株拮抗菌（Na3-38和Nb3-15）对7株指示菌均有较强的拮抗作用,Aa3-22和Mb3-7对7株指示菌中的5株有拮抗效果;除Na3-38和Nb3-15以外,其余12株的生长系数均大于嗜水气单胞菌;11株拮抗菌（Na3-38、Nb3-15、Ab2-55、Ab2-77、Ab1-3、Aa3-22、Aa3-67、Mb1-4、Mb2-10、Mb3-7和Mb3-27）和嗜水气单胞菌的共凝集率大于10%.这表明：Aa3-22和Mb3-7在抗菌谱、生长曲线以及与病原性嗜水气单胞菌的共凝集作用都适合作为益生菌.