腺胃病变型鸡传染性支气管炎病原特性与多肽分析

从患传染性腺胃病的病鸡中分离到4 株病毒,其中H95株在SPF鸡胚上已稳定传代。病料及H95 传代后的鸡胚尿囊液经蔗糖梯度和CsCl密度梯度离心后的纯化物,电镜下为大小80～160 nm 、有囊膜的病毒颗粒,囊膜表面有纤突,呈冠状形态。病毒在CsCl中的浮密度为1.19～1.23 g/cm 3, 对热和氯仿敏感,耐酸,能抵抗1% 胰酶,无直接血凝性,经卵磷脂酶C处理后的病毒则能凝集鸡红细胞,能干扰新城疫病毒在鸡胚上的增殖。应用杂交瘤技术筛选出4 株抗H95株的阳性克隆,经Western blotting, 其中3 株单抗能识别54 kd 蛋白多肽,该条带也能与来自鸡传染性支气管炎病毒(IBV) M41 株的针对N 蛋白的单抗反应。中和试验表明, H95株与其它IBV 毒株在血清型上存在差异。上述研究结果初步表明,鸡传染性腺胃病的病原是冠状病毒科的成员,并且很可能是鸡传染性支气管炎(IB)中以腺胃病变为主要特征的一种新的致病病型。     

ClassⅠ新城疫病毒单克隆抗体的制备

本试验以纯化的新城疫病毒(NDV)弱毒株D58为免疫原免疫6～8周龄BALB/c小鼠,分离脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,经多次ELISA鉴定和血凝抑制试验(HI)筛选和亚克隆培养,获得了4株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞并制备了单抗。经鉴定,4株单抗均有ELISA效价,其中1株单抗有中和活性和HI活性,只与ClassⅠNDV反应,与ClassⅡNDV不反应。该单抗与不同群NDV反应的差异性为NDV的鉴别诊断和不同毒株抗原差异性研究奠定了一定基础。     

3株H1N1亚型猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原特异性分析

【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息,制备全病毒灭活疫苗,各免疫3只雌性新西兰大白兔,采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)反应试验检测抗体滴度。【结果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%,各分支的HA基因的抗原表位存在差异;3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上,且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应,而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。【结论】3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异,可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好,可作为候选疫苗株。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株与疫苗株抗原相关性和S1基因序列分析

本实验挑选8株近年来山东省IBV分离株与疫苗株H120和491,利用SPF鸡分别制备了高免阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,计算其抗原相关系数,鉴定其血清型,并结合S1基因序列分析,研究其血清型和基因型之间的关系.结果显示:SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701与疫苗株H120同属Mass血清型的不同亚型,其它5个分离株与H120和491不属于同一个血清型.结合S1基因序列分析发现,S1基因序列分析与血清中和结果二者不具有明显的相关性,8个分离株分属三个基因群,其中SDTA06111与H120等同属一个基因群,但血清中和实验显示它们不属于一个血清型;CK/CH/SD09/005与一个参考株独自构成一个基因群,其S1基因变异程度较大,并且能够与两个疫苗株发生交叉中和实验,但不属于一个血清型,它可能是一个基因重组后病毒.     

蛋鸡抗IBV HI抗体效价与攻毒后产蛋性能的相关性

【目的】研究抗呼吸型IBV HI抗体水平与蛋鸡产蛋率的对应关系。【方法】将180只SPF鸡分为4组,第1组和第2组首免用鸡传染性支气管炎H120活疫苗免疫,1羽份/只,4周后采血,第2组鸡同时用3批次的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)分别进行加强免疫,试验同时设置攻毒对照第3组和不免疫攻毒对照第4组。灭活疫苗免疫4周后,当产蛋率稳定在80%以上时,对试验鸡采血测定抗体,同时使用M41株病毒进行攻毒,记录攻毒后4周内各组鸡的产蛋性能,分析抗IBV HI抗体水平与攻毒后产蛋性能的相关性。【结果】弱毒活疫苗和灭活疫苗联合免疫组抗IBV HI抗体水平在2-8.2~2-9.3时,免疫鸡能够耐受IBV强毒的攻击,其产蛋性能不受影响。弱毒活疫苗免疫组抗体为2-4.8,产蛋量下降了12.69%。攻毒对照组抗体水平为2-2.0,攻毒后产蛋量下降45.22%。【结论】蛋鸡抗IBV HI抗体效价与产蛋率对鸡传染性支气管炎强毒的攻毒保护之间呈正相关,可以用HI抗体检测来评价鸡传染性支气管炎灭活疫苗对产蛋鸡的免疫效果。     

抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体特性的研究

试验采用琼脂免疫双扩散 ,酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) ,病毒中和试验和 Western-blotting试验对 13株单克隆抗体 ( Monoclonal Antibody,Mc Ab)的特性进行了研究。试验结果表明 ,其中 9株 Mc Abs为 Ig G类 ,4株为 Ig M类 ;这些 Mc Abs仅与抗传染性法氏囊病病毒( Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)发生特异结合 ,而与新城疫病毒 ( Newcastle DiseaseVirus,NDV)、传染性支气管炎病毒 ( Infectious Bronchitis Virus,IBV)和马立克氏病病毒 ( Marek'sDisease Virus,MDV)均不发生交叉反应 ,有 5株 Mc Abs具有中和 IBDV的活性 ,这 5株有中和活性的 Mc Abs识别的抗原位点在 IBDV的 VP2 上     

单抗介导的血凝试验对H9N2亚型禽流感病毒的研究

利用4株鼠源抗H9N2禽流感病毒血凝素单克隆抗体与标准H9N2禽流感多克隆抗体,通过血液凝集抑制试验(Haemoglutination inhibition test,HI)分别对25株H9N2禽流感病毒进行了检测,发现4株单克隆抗体均对其中的23株H9N2禽流感病毒反应,其最高HI效价分别为:A单抗12log2,B单抗12log2,C单抗12log2,D单抗12log2;最低分别为:A单抗3log2,B单抗9log2,C单抗4log2,D单抗6log2,而对其中的2株H9N2禽流感病毒没有HI反应,其HI价均为0;然而,标准多抗对25株H9N2禽流感病毒均产生HI反应。检测结果表明2株H9N2AIV毒株血凝素蛋白出现了抗原漂变。     

IB(M41株)种毒代次和免疫原性的关系

评估不同代次IBV M41株种毒是否可以作为生产用种子。将M41株种毒用SPF胚连传8代,从中选出第3、第5、第7代,测定其EID50。并用此3代M41株鸡胚尿囊液制毒的油乳苗免疫易感鸡,以HI试验检测其抗体水平。3种疫苗免疫鸡均保护9/10以上,对照鸡全发病;对免疫后与免疫前HI抗体水平的比较表明,免疫后抗体平均滴度提高3倍以上。不同代次的M41毒株的免疫原性仍然保持良好,可以正常用来制造疫苗和建立种子批。     

鸡体内传染性支气管炎病毒的分布及消长

对两周龄SPF鸡用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株攻击时,以0．3ml／羽(100EID50)滴鼻人工感染发病,试验鸡出现气管哆音等典型的IBV临床症状,以及气管、肺、肾脏等器官的组织学病变。经nested RT-PCR全程跟踪检测,掌握了IBV M41株经呼吸道感染后动物带毒、排毒的时间规律,从而为控制和降低IB的发生提供参考。     

新城疫病毒广西强毒株的分离与鉴定

从广西某规模化鸡场两个鸡群病死雏鸡中分离到2株有血凝性的病毒，这2株病毒的血凝性均能被新城疫标准阳性血清抑制和中和，经过血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、血清中和试验和RT-PCR检测结果，确定为新城疫病毒。2株病毒的鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为52和54h，脑内致病指数(ICPI)分别为1．975、1．875；鸡胚半数致死量(ELD50)分别为：10^-9.38／0.1mL、10^-9.68／0．1mL，实验结果证明该2株病毒为新城疫病毒强毒株。     

新鱼腥草素钠纳米乳佐剂对肉仔鸡免疫功能的影响

以新鱼腥草素钠纳米乳为免疫佐剂,将其混入传染性支气管炎灭活疫苗,探讨其对肉仔鸡免疫功能的影响。选150只1日龄黄羽肉鸡,随机分成3组,第1组用新鱼腥草素钠纳米乳佐剂疫苗,铝胶佐剂疫苗为阳性对照组作为第2组,第3组为空白对照组(PBS)。免疫后21d(35日龄)采用IBV M41株病毒液进行点眼、滴鼻攻毒。通过测定每组鸡淋巴细胞(PBMC)增殖情况、鸡血清抗体效价、IBV强毒株攻毒保护及组织病理学变化。结果表明:新鱼腥草素钠纳米乳佐剂组PBMC增殖指数、鸡血清抗体效价水平显著提高(P0.05),在IBV M41株攻毒试验中,新鱼腥草素钠纳米乳佐剂组可显著减轻病毒感染肉仔鸡临床症状,肺和肾无明显组织病理学变化,免疫保护率达到96.7%。这表明以新鱼腥草素钠纳米乳佐剂能提高肉仔鸡对传染性支气管炎的免疫力。     

检测感染鸡体内传染性支气管炎病毒反转录套式PCR方法的建立

根据先前克隆并测定的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列，设计了2对引物，通过对IDV各毒株(M41，H52，H120，Aust-T以及野毒株等)攻毒鸡的组织中的IBV进行反转录套式PCR检测，结果均为阳性，而对鸡的其他传染病病毒(IBDV，AIV，NDV)进行检测，结果均为阴性。结果表明所建立的反转录套式PCR方法可用于感染鸡体内IBV各血清型毒株的检测。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝性的研究

用中国和澳大利亚分离的Ａ型魏氏梭菌培养液、Ⅰ型卵磷酯酶Ｃ和胰酶处理鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ），制备的血凝抗原能凝集鸡红细胞，为鸡传染性支气管炎的诊断提供了方法。对鸡传染性支气管炎Ｍ（４１）、Ｈ（１２０）、Ｈ（５２）、Ｇｒａｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｔ、ＧＩＢＶ等７个毒株进行了血凝性的比较，以Ｈ（１２０）毒株血凝价最高，其次是Ｍ（４１）、ＧＩＢＶ、Ｇｒａｙ，而Ｈ（５２）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｔ等毒株血凝性低或无血凝性。作者还对影响鸡传染性支气管炎病毒血凝试验的各种因素进行了研究。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒的分离和鉴定

[目的]鉴定免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒（IBV）。[方法]以接种IBV的鸡胚尿囊液为模板,根据GenBank中登录的IBV的N基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出目的片段,经酶切鉴定后对其进行测序鉴定。[结果]PCR扩增片段长度为409bp,将其Ⅳ基因核苷酸序列与不同地区分离株（山东、黑龙江等）以及欧洲呼吸型疫苗株（M41）的IBV核苷酸序列进行比较,结果表明,不同毒株的核苷酸同源性在85．6％～100．0％,此次分离所得IBV的N基因与IBVSD0708株（EU352625）N基因的核苷酸同源性高达99．3％,而与呼吸型疫苗株M41（M28566）的同源性仅为87．3％。测序结果及序列分析可以证实分离到的病毒为IBV,命名为HN／HL株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎病毒的控制奠定了基础。     

减蛋综合征1976病毒单克隆抗体的制备及其初步鉴定

采用经层析方法提纯的减蛋综合征１９７６（ＥＤＳ‘７６）病毒免疫ＢＬＡＢ／ｃ小鼠。最后一次加强免疫后第３ｄ制备脾脏细胞，然后用５０％的聚乙二醇（ＰＥＧ，分子量４００）融合脾脏细胞和ＳＰ２／０骨髓瘤细胞。通过选择培养、特异性抗体检测、筛选和克隆詈笾票赋觯抵攴置诳固宓南赴辏停玻停常停保埃停保春停停保怠Ｎ⒘垦种剖匝椋ǎ龋桑┲っ鳎停保档タ寺】固寰哂醒种苹钚裕龋杉畚叮ǎ欤铮纾玻     

上海地区鸡传染性支气管炎病毒流行与疫苗株的血清型比较

从上海地区疑有IB感染的病鸡中,分离出4株冠状病毒其中3株为形态典型的传染性支气管炎病毒（IBV）,1株形态上与IBV差异较大。用鸡胚中和试验将这3株典型的IBV与目前使用的IB疫苗株（H株,M_(41)株）进行血清交叉保护率测定,表明上海地区流行的IBV毒株中,有与疫苗株血清型相近的毒株（R>25％）,也有与疫苗株血清型差异较大的毒株（R<25％）。为上海地区IB防治工作及研制更有针对性的疫苗提供了依据。