大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。     

拟南芥MYB4基因GUS载体构建及其转基因植株的筛选

[目的]进一步验证MYB4基因在响应干旱胁迫中的应答功能,构建ProMYB4:GUS载体,通过筛选鉴定获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥植株的全基因组为模板,利用特异性引物扩增MYB4基因启动子,将目的基因连接到pART27载体上。然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌GV3101,浸花法转化野生型植株。最后通过抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因植株。[结果]MYB4启动子成功克隆,测序结果经过比对完全正确。抗性筛选获得了阳性转基因植株。[结论]成功获得ProMYB4:GUS阳性转基因植株,为进一步研究MYB4基因功能奠定了基础。     

ω 3脂肪酸脱氢酶基因Fat 1的真核表达载体构建与表达

培养线虫(Caenorhabditis elegans),提取RNA并通过PT-PCR获得其ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1,整合入真核表达载体,构建了哺乳动物细胞表达载体pFat-IRES2-GFP,转染牛胎儿成纤维细胞系并对其进行G418筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染Fat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的HPLC分析结果表明,Fat-1基因已经整合入牛基因组中,并能够表达和发挥其ω-3脂肪酸脱氢酶的作用,促使-ω6PUFAs转变为相应的-ω3 PUFAs。ω-6脂肪酸总量从35.60%下降到25.47%,-ω3 PUFAs总量从5.75%上升到12.33%,多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.19下降到阳性细胞中的2.07,说明Fat-1基因整合是成功的,能够在细胞中以相应的-ω6 PUFAs为底物合成-ω3 PUFAs。     

猪β防御素-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建标记基因可去除的β防御素-1(pBD-1)基因乳腺特异性表达载体,利用RT-PCR方法从猪脾脏中克隆获得pBD-1基因,再插入乳腺特异性表达骨架载体pBC1-neo中;经PCR、酶切电泳以及测序鉴定,确认成功构建出乳腺特异性表达pBD-1的载体。进一步将上述功能片段亚克隆至能将标记基因全部去除的骨架载体MCS-3s-loxP-GFP中,成功构建了一种筛选标记可全部去除的乳腺特异性3s-loxP-GFP-pBC1-pBD1转基因载体。该载体为研究pBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机制,以及创制乳腺高效表达pBD-1的转基因猪育种新材料和通过哺乳以提高新生仔猪抗病力奠定了基础。     

烟草根特异性启动子植物表达载体的构建及其对番茄的转化

利用PCR技术从烟草中克隆获得了893bp的根特异性表达基因TobRB7的启动子,命名为NT1.以pBI121为原始植物表达载体,用NT1启动子和番茄广谱抗病基因Pto分别取代CaMV 35S启动子和GUS基因,获得了烟草根特异启动子驱动抗病基因的表达载体,命名为pBI-NT1::Pto.采用冻融法将pBI-NT1::Pto导入根癌农杆菌EHA105中,以番茄子叶为外植体进行了侵染转化.PCR检测NPT II基因的结果表明已获得转基因番茄植株.     

人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建及转染研究

构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。     

山羊α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的构建 及核供体细胞的转染

为了构建α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体及提供山羊乳腺生物反应器α-乳清蛋白核移植供体细胞,提取乳腺组织中的总RNA,采用RT-PCR技术获得α-乳清蛋白基因cDNA,测序酶切后连接乳腺特异性表达载体pBCⅠ-Neo,并对重组载体进行酶切测序鉴定;取重组正确的载体酶切线性化后利用脂质体介导转染至山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选培养转染了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞。结果显示:经过RT-PCR特异性扩增克隆出α-乳清蛋白基因;克隆的基因碱基组成序列经测序与预期完全一致,α-乳清蛋白基因片段正向插入乳腺特异性表达载体;重组载体在山羊胎儿成纤维细胞中稳定转染,转入α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体的山羊胎儿成纤维细胞生长迅速,仍保持原有的细胞生长形态。成功构建了α-乳清蛋白乳腺特异性表达载体,获得稳定转染的山羊胎儿成纤维细胞可用于核移植。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

番茄cry1基因果实特异性植物表达-载体的构建及其转化番茄的研究

隐花色素(cryptochrome)是一类对UV-A/蓝光作出应答的光受体.果实特异性植物表达载体是用在番茄果实中特异表达的Lefsm1基因的启动子(fsp)替换质粒pBI121原有的35S启动子构建而成(称为pBI121 fsp).将番茄隐花色素家族成员之一cryptochrome1中465 bp特异片段导入到植物栽体pBI121 fsp构建成果实特异性表达的RNAi植物表达载体(pBlI21fsp-cryI),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.为后续对CRY1与番茄果实中抗氧化剂番茄红素之间的关系研究提供了材料.     

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄果实中特异性表达及其免疫原性的研究

 利用番茄果实特异性启动子-E8启动子,将霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)用根癌农杆菌浸润法转入番茄植株,并使其在果实中特异表达,然后对试验小鼠进行口服免疫,研究转基因番茄果实的免疫原性。结果表明,ctb基因在14株番茄植物基因组中被证实有整合,并在其中2株的番茄果实中有特异性表达,最高表达量分别为455和385 ng·g-1FW,口服免疫后的小鼠血液和肠道粘膜中均检测到抗CTB抗体。表明获得了在番茄果实中特异、高效表达霍乱肠毒素B亚单位基因(ctb)的植物口服疫苗候选植株。     

山羊MC4R基因cDNA的克隆和序列分析及组织表达研究

【目的】克隆山羊黑素皮质素受体4(Melanocortin receptor 4)基因(MC4R)的cDNA编码区和部分5′、3′非编码区序列,分析其在不同组织中的表达规律。【方法】以安徽白山羊的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、大肠、小肠、瘤胃、子宫等组织为材料,运用同源序列克隆技术并结合RT-PCR方法,对其MC4R基因cDNA进行克隆,并对其进行了组织表达和生物信息学分析。【结果】克隆得到了山羊MC4R基因全长,包含999bp的完整CDS编码区,共编码332个氨基酸。山羊MC4R基因与绵羊同源性最高(96.9%),其次为牛(93.5%)。山羊MC4R基因在心脏、肝脏等10种组织中均有表达,其中在肾脏组织中的表达量最高,大肠和小肠组织中的表达量最低。MC4R蛋白的相对分子质量为36 444.0u,等电点(PI)为7.52,分子式为C1 664H2 619N413O454S24,含有7个跨膜结构、5个丝氨酸磷酸化位点、4个苏氨酸磷酸化位点和1个特异蛋白激酶的磷酸化位点。MC4R空间结构包括7个α螺旋和5个β折叠。【结论】MC4R基因在动物进化中比较保守,并具有相似的生物学功能。     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶载体 及其稳转山羊成纤维细胞系的构建

为改善山羊乳品质,创制乳汁中富含n-3不饱和脂肪酸的奶山羊育种新材料,首先构建了一种山羊乳腺特异性表达载体,以实现n-3不饱和脂肪酸合通路中4种脂肪酸合成酶基因(fat-1,fads2,elovl5和scd-1)的共表达。为初步验证该载体的有效性,通过脂质体法转染小鼠乳腺上皮细胞系C127,经G418筛选收集阳性C127转基因细胞,并对其进行反转录PCR(RT-PCR)检测。结果表明,4种基因均可在C127细胞转基因中表达。将该多基因共表达载体转染奶山羊成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系。PCR结果显示,4个目的基因均成功整合到奶山羊成纤维细胞基因组中。总之,本研究成功构建了乳腺特异性共表达4种脂肪酸合成酶转基因载体及其山羊转基因细胞系,为创制乳腺特异性表达多不饱和脂肪酸的转基因奶山羊奠定了基础。     

拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1 629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明：AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。     

水稻rbcS启动子的克隆及其在转基因水稻中的特异性表达

为将高效特异的启动子用于转基因水稻研究,利用PCR技术从水稻‘中花11’基因组DNA中克隆了rbcS启动子,序列分析表明,扩增片段(2 746 bp)与已报道的该基因序列相应区域的同源性达99.2%。将rbcS启动子与GUS报告基因融合构建了由rbcS启动子引导GUS基因的植物表达载体,经农杆菌介导法导入到水稻中。对转基因水稻植株中GU S活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中的特异性表达,其表达水平高于C aMV 35S组成型启动子,而在转基因水稻植株根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织特异性。     

植物凝集素MNB1基因启动子表达载体的构建及鉴定分析

近年来植物受逆境胁迫的影响日益严峻,而逆境胁迫是造成现代农作物减产的重要因素之一。MNB1基因是拟南芥中与甘露糖高度特异性结合的植物凝集素,具有多种生物学功能,对植物的生长发育及逆境胁迫的应答有着至关重要的调控作用。以拟南芥为试验材料,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术成功构建了ProMNB1:GUS植物表达载体,结合浸花法,成功将ProMNB1:GUS载体转化到拟南芥中,最终通过PCR鉴定分析获得ProMNB1:GUS阳性植株,为研究逆境胁迫下MNB1基因的功能及其转录水平的变化提供了重要的依据。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

半胱氨酸蛋白酶基因表达载体的构建及转基因苜蓿的初步研究

【目的】为培育高抗逆的作物品种提供科学依据。【方法】以耐盐苜蓿"中苜1号"为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化苜蓿。【结果】成功构建了含有半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1和报告基因GUS的植物表达载体pCAMBLA1391-CP-GUS,共获得47株抗性再生植株。经PCR和RT-PCR检测,表明外源基因已成功整合到苜蓿基因组中,并在转录水平得到表达。【结论】初步获得了高抗逆的转基因苜蓿新品系。     

丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建

【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因(SmC4H)的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。