芽孢杆菌植酸酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据枯草芽孢杆菌WHNB02植酸酶phyC基因全序列设计一对引物,采用PCR法从含有该基因的pUC18-phyC质粒上获得不含有信号肽序列的phyC基因表达片段,亚克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K的多克隆位点,并电转化毕赤巴斯德酵母GS115.经MD和MM平板筛选、酶活性测定,获得了阳性转化子PP9KC.首次在毕赤巴斯德酵母中实现了有生物学活性芽孢杆菌植酸酶的分泌表达,去糖基化试验表明该植酸酶的分子量为53.5 kD和50.9 kD糖基化程度不同的两种糖蛋白.用麦芽汁半合成培养基对PP9KC进行诱导培养,培养48 h后酶活可达到2453 U/mL,表达量为出发菌株的10.5倍.酶学性质分析表明,其酶促反应最适pH值为7.0,最适反应温度为65℃,经90℃处理10 min,残留酶活性为37℃时的78.2%.     

土曲霉植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

参考已报道的植酸酶基因phyA全序列设计一对引物,用PCR方法从土曲霉穴Aspergillusterreus雪总DNA中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4kb的phyA基因编码区片段,对该片段进行了克隆与序列测定。进一步用该片段构建了pPIC9K-phyA分泌型表达载体,并转化毕赤酵母穴Pichiapastoris雪GS115。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE电泳分析,植酸酶在重组转化子中得到了有效分泌和高效表达。摇瓶诱导发酵132h后发酵液中植酸酶的活性可达167u·mL-1;表达产物在pH2.0～8.0均有活性,最适pH为5.5,最适温度为55℃。     

来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

 应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I     

酸性植酸酶phyB在毕赤酵母GS115中的表达

通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70℃条件下处理60 min,该酶的相对酶活力为40%,在75℃时处理10 min,该酶的相对酶活力为10%.     

产植酸酶菌株青霉P11发酵条件的研究

研究了不同碳源、氮源等对青霉(Penicillium)P11液体发酵产植酸酶的影响。菌株P11发酵产植酸酶的最佳碳源为蔗糖,氮源为蛋白胨和硝酸铵。最适发酵产酶条件为培养温度30℃,发酵培养基最适pH值5,摇瓶装液量10%,接种量4%,摇床转速120r/min,培养时间96h,最高酶活性可达2.63U/mL。     

雪莲类PEBP基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了构建雪莲类PEBP基因真核表达载体,在毕赤酵母中表达并鉴定.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到真核表达载体pPIC9k上,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Muts(methanol utilization slow)重组酵母株进行表达,经SDS-PAGE分析,表达产物置于低温条件下进行抗冻试验.结果在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为20 kD,与预期相符,上清液抗冻检测表明PEBP具有一定的抗冻性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达.该研究成功构建了真核表达载体pPIC9k-PEBP,获得了表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母GS-115系统中的表达

将黑曲S（Aspergillus riger）NRRL3135中的植酸酶基因转入毕赤酵母GS-115中,并整合到染色体DNA上,然后进行诱导表达。通过SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,发现重组毕赤酵母GS-115分泌了1个约100kD的蛋白,分泌的蛋白较大。用脱糖基化酶endoglycosidase H降解后,形成了约50kD的蛋白,与植酸酶基因产物的理论值相符。通过对表达产物的酶学性质研究,发现该表达产物在pH2．5和pH5．5时具有较高植酸酶活性,同时该表达产物的最适温度约为55℃。这说明植酸酶得到正确的分泌表达。     

来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]研究植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达。[方法]用PCR方法从嗜热真菌(Thermomyces sp.)中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4 kb的phyT基因编码区片段,并对该片段进行克隆与序列测定。[结果]序列相似性分析表明,克隆的植酸酶基因无信号肽和内含子,与报道的嗜热真菌Thermomyces lanuginosus植酸酶基因相似性最高,DNA序列相似性为95%。从验证后的转化子筛选得到了表达嗜热真菌植酸酶的重组毕赤酵母菌株p-phy T,SDS-PAGE分析显示其分子量约为45 kD,重组毕赤酵母成功表达植酸酶。与野生型菌株相比,结果显示重组植酸酶酶活性提高了12.6%,最适温度65℃,75℃仍有64%以上酶活活性;最适pH值为5.5。[结论]嗜热真菌植酸酶基因用组成型质粒能在毕赤酵母中表达。     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。     

利用透明颤菌血红蛋白在低氧条件下提高毕赤酵母中植酸酶的表达

为了提高毕赤酵母(Pichia pastoris)中重组植酸酶的表达,在来源于Pichia stipitis的低氧诱导启动子PsADH2控制下,进行了透明颤菌血红蛋     

鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.     

哈密地区瓜列当茎腐病病原菌的分离与鉴定

为了查清新疆哈密地区瓜列当茎基腐病的主要种类,从哈密地区采集寄生在甜瓜上的瓜列当茎基腐病样品,对病原物进行分离、纯化和致病性测定,并对病原物进行形态学和分子生物学鉴定。结果表明,从130个样品上共计分离获得105个分离物,其中腐霉菌39个,占分离总数的37.14%;丝核菌34个,占32.38%;镰刀菌21个,占20%;其他11个,占10.48%。依据形态学特征和ITS序列分析鉴定腐霉菌,得到2个种,分别为瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)和终极腐霉(Pythium ultimum)。瓜果腐霉是引起哈密地区瓜列当茎基腐病的主要致病菌。     

斑点叉尾(鱼回)LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

LEAP-2 (Liver expressed antimicrobial peptide-2) 抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,其生物学活性来自成熟肽区域,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。本文以斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) LEAP-2成熟肽(mLEAP2)为研究对象,拟通过建立毕赤酵母表达系统,实现mLEAP2在毕赤酵母中的重组DNA表达,以期获得具生物学活性的重组体mLEAP2 (rmLEAP2),为进一步研究其功能和扩大制备奠定基础。首先以既有的斑点叉尾鮰mLEAP2的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板,通过PCR扩增,获得5’端含EcoRⅠ酶切位点、3’端含NotⅠ酶切位点及6×his标签的LEAP-2成熟肽基因mLEAP2,然后将其与真核表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”;电转化至毕赤酵母GS115细胞中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选,获得高拷贝酵母转化子;在29 ℃、250 r/m条件下,以0.5%的甲醇对其诱导表达120 h;采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,通过MALDI-TOF/TOF质谱对纯化产物的结构进行分析和鉴定。结果表明：表达的重组体蛋白为预期的目的蛋白rmLEAP2,其表达量约2.2 mg/L;另一方面,抑菌实验结果显示rmLEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性。     

基于ITS条形码的云南丹参及其近缘种鉴定研究

选取来自8个产地的材料, 进行DNA提取、PCR扩增、测序。通过ITS条形码及其二级结构对云南丹参和正品药用丹参进行鉴定和聚类分析。采用DNAMAN 8.0进行碱基统计和序列比对; 应用软件MEGA 6.0构建NJ系统进化树; 并应用软件RNAstruct 6.0对各样品序列的ITS1和ITS2进行二级结构预测。结果表明:云南丹参和正品药用丹参ITS序列之间存在明显的差异, 在NJ系统树上分为两支, 其中5.8S rDNA序列基本一致, 表现出高度的保守性。2级结构预测结果显示ITS1和ITS2区表现出了较大的种间差异。因此ITS序列可以作为云南丹参、正品药用丹参及其他近缘种的鉴别方法。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原域在毕赤酵母中的表达

对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。     

Secretive Expression of Insect Antifungal Peptide-Encoded Genes in Pichia pastoris and Activity Assay of the Products

The antifungal peptides, drosomycin （Drs） and its isoform drosomycin-like C （Drs-lC） from Drosophila melanogaster and Thanatin from Podisus maculiventris, have potent activity with broad spectrum against filamentous fungi. Secretive expression of these genes in yeasts makes it possible to utilize the supernatants of yeast culture as protective reagents on fruit, vegetable, food and other agricultural products. So the study of effective secretion by yeast expression system is of great importance. Three genes, Drs, Drs-lC, and Thanatin, were cloned into pPICZαA and the recombinant vectors, pPICZαA-Drs, pPICZαA-Drs-lC, and pPICZαA-Thanatin were transformed into Pichia pastoris by the electric transfer method. The recombinant P. pastoris, which was screened by phenotype selection and PCR amplification, was induced to express antifungal peptide by methanol. The expressive products of the three recombinants showed antifungal activity against 5 out of 6 test fungi strains, and the products of Thanatin also had strong activity against the tested bacteria. The three antifungal peptide genes, Drs, Drs-lC, and Thanatin, were constructed into yeast P. pastoris. The expressed peptides were successfully secreted into the culture medium and exhibited potent activities against the test strains.     

小麦植酸酶基因TaPHY1的克隆、分子特征和表达特性研究

利用小麦植酸酶基因PAPhya1进行同源查找,获得1个与该基因高度同源、尚未开展分子特征和生物学功能研究的小麦新型植酸酶基因TaPHY1.TaPHY1的全长cDNA序列为1771 bp,编码548个氨基酸残基,TaPHY1含有紫色酸性磷酸酶(PAP)类植酸酶通常含有的保守域Metallophos、Purple acid...     

小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1在毕赤酵母中表达的探索

以已构建的含有小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的重组质粒pGEM-XYGluD3-LMWGS1为模板,利用设计的序列特异引物,扩增基因XYGluD3-LMWGS1编码区,构建成巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-XYGluD3-LMWGS,将其线性化后用电激法导入甲醇型酵母（Pichia.pastoris）菌株GS115中;利用pPIC3.5K特征引物进行PCR鉴定,筛选得到重组转化子,将重组转化子进行蛋白诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,XYGluD3-LMWGS1基因未能在毕赤酵母中成功表达。     

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶（ANS）基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘（Vaccinium spp.）品种“北陆”（V.corymbosum L.）为试材,并以Illumina测序文库（NCBI登录号：SRA046311）中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424 bp,包含93 bp的5′非编码区、248 bp的3′非编码区和1个长度为1 083 bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2酮戊二酸和Fe²⁺依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。