巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

小麦3个NAC转录因子基因克隆与功能分析

NAC类转录因子参与植物基因在不同条件、不同发育期的表达调控,在植物的发育、生长及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫应答中起关键的调控作用。本研究对非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29＊6/Yr5的cDNA文库进行筛选及同源克隆,获得了小麦3个NAC类转录因子的cDNA序列。序列分析结果表明,这3个转录因子都具有DNA结合结构域,即NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的A、B、C、D和E5个亚区高度保守;同时发现这3个NAC类转录因子都有核定位信号及相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,发现其中之一的TaNAC1属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,TaNAC3属于ATAF1亚组,TaNAC5属于NAM亚组;根据系统进化树和相关基因的功能分析,我们推测小麦转录因子TaNAC1、TaNAC3和TaNAC5可能参与植物生长发育调控或对生物、非生物胁迫作出的应答反应。     

植物抗逆反应中的转录因子网络研究进展

植物生长发育过程中会经历各种生物及非生物胁迫,转录因子所介导的基因表达调控网络在植物抵御各种胁迫反应中起着重要的作用.目前已鉴定的与植物抗胁迫有关的转录因子及家族主要有碱性域亮氨酸拉链(basic-domain leucine-zipper,bZIP)、禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)、乙烯应答元件组合蛋白/因子(APELATA2/ethylene-responsive element binding proteins/factors,AP2/EREBP)、WRKY和NAC等.这些转录因子与特定的顺式作用元件结合组成调控网络,特异地调控植物胁迫反应中各种相关抗性功能基因的表达,提高植物对环境胁迫的适应能力.     

干旱、高盐及低温胁迫下植物生理及转录因子的应答调控

干旱、高盐及低温等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。这些环境胁迫因子通常导致植物体内生理代谢改变,并参与非生物胁迫调控转录因子的差异表达。植物抵御上述非生物逆境的能力与转录因子调控逆境相关功能基因的表达密不可分。近年来,发掘植物非生物胁迫相关转录因子的功能及揭示转录因子介导植物非生物胁迫响应的调控机制,已成为植物营养分子生物学关注的热点之一。因此,了解植物非生物胁迫下的生理应答及转录因子参与的调控机制,对建立植物适应性改良途径具有重要科学意义。本文从干旱、高盐和低温三方面阐述了非生物胁迫下植物生理生化的适应性变化,概述了MYB、bZIP、AP2/EREBP、WRKY和NAC五类与植物抗逆相关的转录因子的结构与功能特征,着重论述了转录因子介导植物抵御非生物胁迫的分子调控机制。植物遭遇非生物胁迫时,通常表现为生长速率、叶面积和叶片数量下降,蒸腾及光合速率降低。同时,植物体内活性氧逐渐累积,使细胞膜脂过氧化程度加剧,造成细胞损伤。为适应不利环境,在生理上植物表现为体内抗氧化酶活性增强,渗透调节物数量增多;在分子水平上,植物对非生物胁迫适应性的增强,通常与转录因子识别抗逆基因启动子特异性元件及调控逆境防御基因的转录有关。本文对于深入阐明干旱、高盐及低温胁迫下植物生理生化应答与转录因子的分子调控机制提供了全新的科学启示。     

高羊茅DREB类转录因子基因的分离及鉴定分析

DREB转录因子是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关的反式作用因子。为了分离和鉴定高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)DREB转录因子基因,我们构建了冷诱导(4℃)的高羊茅cDNA文库,用拟南芥DREB1A基因作探针筛选该文库得到一个DREB类基因FaDREB1。序列分析表明,FaDREB1具有一个651bp的开放阅读框和229bp的3’非编码区,推测的氨基酸序列中含有一个高度保守的EREBP/AP2结构域。酵母单杂交结果表明FaDREB1蛋白能在体外特异结合DRE元件,并具有转录激活功能。Northern杂交结果发现FaDREB1基因受低温的诱导表达,对高盐、干旱和ABA没有反应,说明FaDREB1基因在高羊茅植株对低温的应答反应中起重要作用。     

葡萄NAC转录因子家族生物信息学分析

NAC基因家族是植物所特有的一类重要转录因子,广泛参与植物生长、发育以及器官建成、逆境胁迫应答等反应。目前,基因组信息的挖掘和分析已经成为葡萄功能基因组学研究的重要组成部分。本文利用生物信息学方法对葡萄143条NAC蛋白序列的系统发生和NAC基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了葡萄与拟南芥的NAC基因家族之间的联系。结果显示这143条蛋白序列与拟南芥94个NAC基因蛋白序列一起分成了16个亚族,说明拟南芥与葡萄NAC基因间具有较高的保守性。基因组定位结果发现143条NAC基因分布在17条染色体上。研究还发现不同亚家族间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;而它们的二级结构都主要以随机卷曲为组成部分,且143条氨基酸序列三维结构十分相似。本文试验结果将为葡萄NAC基因家族的进一步功能分析提供重要研究基础。     

WRKY转录因子表达谱的研究进展

环境胁迫对植物的生长发育造成重大影响,因此,提高植物的抗逆性是农业面临的重要问题。自然界中存在多种抗逆基因,如抗盐基因、抗旱基因、抗寒基因等。利用植物基因工程和分子生物学技术提高植物对逆境的适应性及其抗逆分子机制的研究已成为当今热点。WRKY转录因子是一类参与多种胁迫反应的诱导型转录因子,本文综述了WRKY转录因子家族的结构特点、WRKY转录因子在非生物胁迫（高温、低温、干旱、盐）、外源物质（激素及O3）处理及生物胁迫下的表达模式。各种胁迫下的表达谱均呈现不同特点,这些差异表达可能与它们所行使的不同生物学功能有关。     

茶树CsDREB-A2转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)类转录因子在植物逆境信号转导途径中具有重要的调控作用。为了解AP2/ERF转录因子在茶树逆境胁迫的分子调控机理,本研究从茶树龙井43叶片的cDNA中克隆得到一个编码CsDREB-A2转录因子的基因;对CsDREB-A2基因及其编码蛋白序列特征进行分析,并利用实时荧光定量PCR法检测该基因在茶树不同非生物胁迫处理下的表达水平。结果表明,CsDREB-A2基因开放阅读框为1 056 bp,编码351个氨基酸,其编码氨基酸序列具有AP2保守结构域,包含典型的YRG元件和WLG基序。AP2结构域第14、第19位氨基酸分别为缬氨酸和谷氨酸。拟南芥AP2/ERF家族转录因子的进化分析表明,该转录因子属于DREB亚族的A2组。CsDREB-A2相对分子质量为39 080 Da,理论等电点为5.32,属于亲水性蛋白,主要由α-螺旋和随机卷曲组成,无序化特征明显且存在一个LM无序区域;可能定位于细胞核,不存在信号肽和跨膜结构,属于非分泌蛋白。CsDREB-A2基因在高温(38℃)和干旱(200 g·L^-1 PEG)胁迫下均能快速诱导表达,并显著高于对照,分别在处理4、2 h达到最大值,为对照的20.70和42.90倍,植物在渗透胁迫下,可能通过ABA信号途径调节该基因对干旱的耐受性。高盐(200 mmol·L^-1 NaCl)胁迫下CsDREB-A2基因的表达受抑制,推测其可能存在负调控结构域降低该基因在盐胁迫下的表达量。本试验结果为研究DREB类转录因子在茶树抗逆胁迫的分子调控机制提供了一定的理论参考。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

玉米NAC转录因子基因ZmNAM的克隆及表达分析

为探究候选基因ZmNAM的功能,本研究从甜玉米自交系1132及其变异系704中克隆得到该基因。生物信息学分析表明,ZmNAM的c DNA长度为1 548 bp,开放阅读框(ORF)为1 302 bp,编码一个由433个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白具有亲水性,N-末端具有保守的NAC结构域,定位于细胞核中,具有9个糖基化位点和35个磷酸化位点;与自交系1132相比,变异系在非编码区与编码区中的C-末端转录激活功能域对应核苷酸序列中存在差异,可导致多个氨基酸发生变异。系统进化分析结果表明,玉米ZmNAM蛋白属于NAC转录因子家族中的VND亚族,与拟南芥中的At VND3亲缘关系最近;时空特异性表达分析表明,不同发育时期内ZmNAM在根中的表达量明显高于其他器官,说明ZmNAM基因可能在调控玉米根部的生长发育过程中发挥着重要作用。变异系704中ZmNAM在各个发育时期和发育器官中表达水平基本都明显高于自交系1132,其中在根中的表达水平差异最明显。本研究结果为深入研究ZmNAM基因在玉米生长发育过程中的作用提供了理论支持。     

转录因子在植物进化和抗逆中的作用

植物基因的表达调控是一个复杂且精准的网络系统,一般包括转录水平和翻译水平二个层次。转录水平的调控发生在基因表达的初期,是许多基因表达调控的主要方式。在此调控过程中,被称为转录因子的蛋白质特异结合到靶基因的顺式作用元件上,控制着一系列相关基因的表达,在植物生长发育、物种起源和逆境胁迫应答过程中起着非常重要的作用,是生物遗传多样性的重要遗传基础。由于转录因子的重要作用,人们对其作用机理的理解也日渐深入。根据近期的研究进展,本文就转录因子在植物驯化、生物和非生物逆境胁迫方面的工作进行概括梳理,希望读者对此领域有一个比较深入和系统的认识,同时也能为挖掘具有关键功能的转录因子,提高重要农作物的遗传改良效率提供借鉴。     

番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

大豆MYB 转录因子GmMYBZ2 的鉴定、突变分析及原核表达

大豆（Glycine max）GmMYBZ2基因是典型的植物R2R3-MYB转录因子家族成员之一。通过DNAMAN和酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其蛋白结构和转录活性进行了分析鉴定,并在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了原核表达。GmMYBZ2除含有典型的R2R3-MYB转录因子的结构特征外,在C端含有1个少有的保守氨基酸基序PDLNLELTIS及一个隐藏的锌指结构。基因组序列分析表明,在263～395 bp位含1个132 bp的内含子。为明确GmMYBZ2 C端保守氨基酸基序及锌指结构对目的蛋白转录活性的影响,分别进行了PCR介导的序列删除突变。酵母单杂交系统分析显示,内含子、保守基序及锌指结构对目的蛋白的转录活性均有抑制作用;原核表达显示,目的蛋白能在补充有稀有密码子的大肠杆菌中成功表达。     

玉米转录因子ZmBES1/BZR1-7基因克隆及功能分析

BES1/BZR1蛋白是油菜素内酯信号途径的唯一转录因子,在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。为了探究玉米ZmBES1/BZR1-7基因的功能,从玉米自交系B73中克隆到ZmBES1/BZR1-7基因,并对其功能进行初步分析。序列分析结果表明,ZmBES1/BZR1-7基因无内含子,开放阅读框(ORF)长975 bp,编码324个氨基酸。ZmBES1/BZR1-7蛋白N端高度保守,包含bHLH结构域,与水稻OsBZR1-1相似性达75.95%。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBES1/BZR1-7在玉米叶和根中的表达受渗透与盐胁迫诱导显著;16% PEG-6000和100 mmol·L^-1 NaCl处理12 h,叶片中ZmBES1/BZR1-7表达量分别为对照的17.8倍和19.8倍。酵母激活试验结果表明,ZmBES1/BZR1-7蛋白具有转录激活活性。共相关分析结果表明,玉米中有72个基因与ZmBES1/BZR1-7基因的表达相关性较高,启动子区均含有E-box或BRRE元件,推测可能是ZmBES1/BZR1-7转录因子调控的靶基因,主要参与细胞、细胞组分、细胞代谢过程等。本研究结果为深入解析玉米ZmBES1/BZR1-7的功能及其调控网络奠定了基础。     

胡萝卜DcDREB-A6亚族转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

干旱响应元件结合蛋白(dehydration responsive element-binding protein,DREB)类转录因子是干旱应答元件的结合蛋白,在植物响应非生物胁迫时发挥重要作用。本研究基于胡萝卜(Daucus carota L.)转录组数据,检索和拼接获得一个胡萝卜DREB类转录因子基因序列,并根据其序列设计引物,采用RTPCR方法从黑田五寸获得该胡萝卜转录因子基因DcDREB-A6(GenBank登录号:KM386646)。序列分析显示,来源于胡萝卜中的DcDREB-A6基因含有993 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸。氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性和三级结构分析结果显示,胡萝卜DcDREB-A6转录因子蛋白质分子量为36.68 kD,等电点为6.00,属于亲水性蛋白。进化树分析显示,DcDREB-A6属于APETLA 2/乙烯反应元件结合蛋白(AP2/ERF)家族转录因子中DREB亚族中的A6组。空间结构表明,该转录因子结构域具有典型的植物AP2/ERF家族转录因子的结构特征,有1个α螺旋和3个β折叠。实时定量荧光PCR证实,胡萝卜DcDREB-A6转录因子基因受高温、低温和高盐胁迫诱导,分别在高温、低温处理4和2 h后表达量增加2倍左右;盐胁迫对其影响较大,处理8 h时,基因表达量增加4.6倍;而干旱胁迫下该基因表达变化幅度相对较小。胡萝卜DcDREB-A6转录因子基因能够响应高温、低温、干旱和高盐等非生物胁迫,本研究结果有助于进一步开展胡萝卜DREB类转录因子的逆境调控研究。     

花生中低温胁迫相关转录因子基因的筛选

为了研究花生低温胁迫下的基因表达调控机理,以花生花育19为材料,通过低温处理后芯片杂交实验,筛选花生叶片中低温胁迫响应转录因子基因。结果表明,175个具有转录调控活性的基因在低温胁迫的花生叶片中表达变化量达到2倍以上,其中92个为上调基因,83个为下调基因。通过基因功能分类分析发现,这些基因中53个上调基因和46个下调基因编码转录因子。进一步分析发现,参与花生低温抗性调控的转录因子主要包括MYB、WRKY、NAC及AP2/ERF等家族蛋白。此外,一些不包含已知保守结构域的转录因子也参与了花生低温抗性调控。本研究为花生低温抗性调控研究提供了新的转录因子基因资源。     

华东葡萄抗白粉病转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

以抗白粉病华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系白河-35-1为材料,在经葡萄白粉病病原菌（Uncinula necator（Schw.）Burr.）诱导后获得的EST序列的基础上,本研究通过RACE技术克隆了一个具有转录域的转录因子全长1324bpcDNA序列,其阅读框为1053bp,编码350个氨基酸,命名为VpRFL1（GenBank登录号：FJ356672）。应用PCR技术,进一步获得了转录因子VpRFL1基因的DNA序列,其序列全长1599bp,VpRFL1基因包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析表明,华东葡萄白河-35-1VpRFL1基因编码的氨基酸序列在N端含有核定位信号,C端含有C4C4型RING锌指结构域。VpRFL1/PBI221-GFP在洋葱（Alliumcepa）表皮细胞中的瞬时表达分析表明,该转录因子主要定位于细胞核内。VpRFL1的序列特征与定位分析结果初步表明该转录因子基因在核内起作用,并可能参与了抗逆反应的相关途径。     

WRKY转录因子调控植物养分吸收利用及重金属解毒的研究进展

WRKY蛋白是植物特有的一类重要转录调控因子，它们通过与下游基因启动子上的W-box元件特异性结合诱导或抑制相关基因的表达，从而调控植物生长发育以及植物对生物和非生物胁迫的响应。植物WRKY基因组数目多，在拟南芥、大豆和水稻基因组中已经分别鉴定出74、182和109个，在植物对干旱、盐害、高温、养分匮乏和病原体感染等各种生物、非生物胁迫的响应过程中起关键作用。例如AtWRKY45和AtWRKY75参与调控拟南芥应答低磷养分胁迫，GmWRKY142正向调控拟南芥对镉胁迫的耐受性。在植物面对逆境胁迫时，WRKY蛋白通过与养分相关基因启动子的W-box元件特异性结合，进而实现自我调节或交叉调节，激活或抑制下游基因的转录以应对各种逆境胁迫。众多WRKY下游靶基因也已被鉴定出来，例如PHT家族成员与磷营养相关；3个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因参与调控植物对氮素的吸收利用；6个拟南芥WRKY基因、10个大豆WRKY基因和5个水稻WRKY基因调节植物应对低磷胁迫；2个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因影响植物对钾的吸收利用；3个大豆WRKY基因参与调控植物对硫营养的吸收利用；1个拟...     

花生AhNAC53基因的克隆及干旱胁迫下的表达分析

为探究NAC转录因子在花生生长发育和抗逆反应中的功能,本试验在花生J11叶片中克隆得到一个NAC基因,并利用实时荧光定量PCR技术(RT-qRCR)对NAC基因表达模式进行了分析。结果表明,NAC基因全长1 752 bp,共编码583个氨基酸,分子量64.924 k Da,等电点4.42,亚细胞定位结果预测该NAC蛋白主要在细胞核中,进化树分析结果表明其与大豆GmNAC53亲缘关系较近,将其命名为AhNAC53。RT-qRCR结果表明,AhNAC53基因在花生不同组织中均有表达,其中在叶中的表达量最高;不同程度的干旱胁迫下其表达量存在显著差异,除在10%PEG6000胁迫下基因表达量相对变化较小,其他胁迫程度(5%、15%和20%PEG6000)下,随着处理时间的延长,AhNAC53基因表达量均呈现较大幅度的上调,且均在处理48 h时达到峰值,进一步表明AhNAC53基因可能参与了花生的生长发育和对干旱胁迫的响应。本试验结果为深入研究花生AhNAC53基因的功能奠定了一定的理论基础。