猪瘟兔化弱毒株E2蛋白A/D抗原区基因的原核表达

通过RT—PCR扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒囊膜糖蛋白点E2基因；另行设计引物，扩增其中一段所编码的蛋白质抗原性好且适于在大肠杆菌(Eschedchia coli)中表达的基因(E2蛋白AID抗原区)，构建了不同的重组原核表达载体(pTH-E2来源于pThioHisB载体；pET—E2来源于pET-32a( ))，并对其表达特性进行了研究。将其分别转化到相应的宿主菌中，构建成2株重组工程菌(TOPE2含有pTH—E2；BL21E2含有pET—E2)。结果表明，两种重组菌都获得了高效表达，但BL21E2表达量明显高于TOPE2。另一重要发现是，在E2蛋白上，除了690～812位肽段，所选肽段在大肠杆菌中表达后，也能和抗猪瘟病毒高免血清反应。     

抗人红细胞单链抗体（ScFv）-伪狂犬病毒（PRV）gE蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

利用特异性引物从重组质粒pMD-2E8ScFv和pMD-gE中PCR扩增出2E8基因(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和kgE基因(PRVgE主要抗原编码区),采用重叠延伸(SOE)PCR法拼接成融合的双功能分子2E8kgE,经BamH I和EcoR I双酶切,纯化后,克隆至BamH I和EcoR I双酶切的表达载体pET-Trx中,构建了原核表达载体pET-Trx-2E8kgE;将pET-Trx-2E8kgE转化至BL21plysS中,在IPTG诱导下表达具有双功能的融合蛋白,经过SDS-PAGE和Western-blot检测;结果表明,重组菌BL21plysS表达出约60.1 kD的目的蛋白,与猪伪狂犬标准阳性血清发生特异性反应.红细胞凝集试验证实,2E8kgE融合蛋白既能够与人红细胞结合,又能够与PRV抗体反应,具有双功能特性.     

PCV2衣壳蛋白羧基端基因在T4噬菌体表面的展示

用PCR扩增猪圆环病毒II型广东分离株的衣壳蛋白羧基端基因,将PCR产物连接到重组型质粒pR上,转化DH5α细胞并筛选阳性克隆;重组质粒经PCR鉴定并测序后,转化E2菌,将重组E2菌与缺陷型噬菌体T4-Z1同源重组后,得到重组噬菌体,SDS-PAGE和Westernbloting分析,表明衣壳蛋白基因在噬菌体表面正确展示,表达的融合蛋白的分子量约为25Ku。     

Gateway^TM系统快速构建番木瓜环斑病毒CP基因反向重复序列表达载体

设计含有attB侧翼序列的引物,用于番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus)的外壳蛋白基因(CP)基因的PCR扩增.在BP重组酶的作用下,将CP基因与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆.在LR重组酶作用下,将入门克隆与目的载体pHellsgate12发生重组反应,再进行平板培养筛选及PCR扩增和酶切反应.结果证明,用限制性内切酶Xho I酶切消化后,琼脂糖凝胶电泳获得了预期长度为1700 bp的重组片段;以启动子和外壳蛋白基因及外壳蛋白基因和终止子序列为基础,分别设计2对引物,经PCR扩增分别获得582和773 bp片段.结果表明,获得了含有内含子的CP基因反向重复结构的表达载体.     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒系统中表达与活性鉴定

摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。     

草莓果实特异表达基因annfaf 在E. coli 中的表达及抗血清的制备

摘要：将草莓?穴Fragaria ananassa Duch. ?雪果实中特异表达的膜联蛋白基因annfaf的cDNA连接重组到pET-30a质粒中，构建了融合和非融合蛋白表达载体。annfaf 基因转化大肠杆菌(E. coli )后以包含体形式得到了高效表达，同时研究了annfaf基因表达的影响因素。实验结果表明, 最佳培养温度是37 ℃ ，培养时间为4 h，当培养液中加入利福霉素时可明显提高表达量中目的蛋白的含量。SDS-PAGE检测表明该蛋白分子量为35 kD，与目的蛋白相同。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗Annfaf蛋白的抗血清。ELISA检测及Western印迹表明，制备的抗血清可与其免疫抗原发生特异的免疫学反应，且具有较高的效价。该实验结果为进一步研究Annfaf蛋白在草莓果实细胞中的定位及其生理功能奠定了基础。     

家蚕真核细胞翻译起始因子(BmeIF4E)基因的克隆、表达及功能分析

本研究从自建的家蚕(Bombyx mori)蛹期cDNA文库中筛选到一条cDNA序列,发现其在序列和结构上与其他物种的真核细胞翻译起始因子钮基因(BmeIF4E)具有较高的相似性,推测可能是家蚕eIF4E基因,将该序列命名为BmeIF4E,GenBank登录号为DN443192.为研究BmeIF4E的生物学功能,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白,制备多克隆抗体.利用家蚕Bm5细胞进行亚细胞定位研究结果表明,BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中.荧光定量PCR和Westem blot分析结果表明,在不同组织及发育时期该基因的表达有差异,在各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺;在卵、幼虫、蛹和蛾4个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量较低.以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA,脂质体法转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白作Western blot检测RNA干扰情况,发现BmeIF4E基因被干扰后,总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照组.MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降.研究结果提示,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均有表达,起着十分重要的作用.     

草莓果实特异表达基因annfaf在E.coli中的表达及抗血清的制备

将草莓(Fragaria ananassa Duch．)果实中特异表达的膜联蛋白基因annfaf的cDNA连接重组到pET-30a质粒中，构建了融合和非融合蛋白表达载体。annfaf基因转化大肠杆菌(E.coli)后以包含体形式得到了高效表达，同时研究了annfaf基因表达的影响因素。实验结果表明，最佳培养温度是37℃，培养时间为4h，当培养液中加入利福霉素时可明显提高表达量中目的蛋白的含量。SDS—PAGE检测表明该蛋白分子量为35kD，与目的蛋白相同。以表达的蛋白作抗原免疫家兔，制备了抗Annfaf蛋白的抗血清。ELISA检测及Western印迹表明，制备的抗血清可与其免疫抗原发生特异的免疫学反应，且具有较高的效价。该实验结果为进一步研究Annfaf蛋白在草莓果实细胞中的定位及其生理功能奠定了基础。     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达及间接ELISA诊断方法的初步建立

根据猪圆环病毒2型（PCV2）LC株序列,设计合成3对引物,通过PCR扩增PCV2的3个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到pET-32a载体中,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,表达并纯化了重组蛋白。Western-blot分析表明,重组蛋白可以与PCV2阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白初步建立了间接酶联免疫吸附实验（ELISA）方法,经方阵滴定确定最佳包被浓度为0．24μg／mL,血清最佳的稀释度为1：40。     

Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的截短表达与鉴定

本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。     

重组海参溶菌酶C端基因(SjLys-C)的可溶性表达和抑菌活性分析

为进一步研究海参(Stichopus japonicus)溶菌酶基因(Sjys)(Genbank登录号:EF036468)中不司片段表达产物的生物特性,本研究通过对其cDNA片段的分析,发现C端基因区域所对应的蛋白质序列中含有非酶活性.根据已知的海参溶菌酶的cDNA序列,设计山含有Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的特异性引物,从新鲜的海参肠中提取总RNA,以其为模板利用RT-PCR扩增出长度为259 bp的溶菌酶C端(SjLys-C)基因.将该目的基因连接到pET-32a(+)载体上,构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-C,再转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组蛋白SjLys-C的基因工程菌.利用该工程菌诱导发酵,结果显示它能高效表达出26 kD左右的重组蚩白SjLys-C.经过Western blot分析,该重组蛋白在26 kD左右能够与Penta-His抗体发生特异性免疫反应.对纯化的重组蛋白SjLys-C进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahae molytic us)有较高的抑菌活性.此外,将该重组蛋白经100℃、40 min处理后,其抑菌能力提高了5％～21％.研究结果表明,重组蛋白SjLys-C基因工程菌能够制备出具有可溶性的、并具有抑菌活性的重组蛋白SjLys-C,在农业和医药等行业中有潜在应用和开发价值.     

抗对硫磷基因工程抗体ScFv的制备及其初步鉴定

用一段45个核苷酸的片段连接抗对硫磷抗体重链和轻链可变区基因片段VH和VL,获得了抗对硫磷单链抗体(single chain variable fragment,scFv)基因,构建了抗对硫磷scFv基因原核表达载体。SDS-PAGE和Western blot分析显示,该单链抗体基因能在大肠杆菌Origami 2中特异性表达,融合蛋白分子量约为28kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到目的蛋白纯度为74.8%;ELISA反应结果证明,该单链抗体可以与对硫磷发生特异性反应。     

表达禽流感病毒核蛋白重组噬菌体的构建

摘要：利用PCR技术，扩增去除部分序列、长度为1320 bp、编码440个氨基酸的禽流感病毒(AIV)NP基因片段，将其克隆至pR质粒的T4噬菌体SOC基因C末端获得重组质粒pR-NP，以此重组载体转化大肠杆菌E2，用溶菌酶缺陷噬菌体T4-Z1感染重组E2菌，重组载体与缺陷噬菌体T4-Z1基因发生同源重组，将NP基因整合到噬菌体基因组中，用PCR方法筛选重组噬菌体并命名为T4-Z1-NP。经Western blot检测证实，T4-Z1-NP表达的NP融合蛋白具有免疫学活性。成功构建了表达禽流感病毒核蛋白的重组噬菌体。     

口蹄疫病毒3D蛋白在T4噬菌体衣壳表面的展示

本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。     

Ⅰ群禽腺病毒33K基因的原核表达与鉴定

33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ）的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的高效可溶表达及抗原性分析

将猪源Ｏ型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1基因克隆到原核表达载体pMBX上，成功地构建重组表达质粒pMBX-VP1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中，经SDS-PAGE分析，融合蛋白分子量约为58 kD，表达产物占菌体总蛋白的35.5％。 经蛋白可溶性分析，目的蛋白在裂解沉淀中占6.8％，在裂解上清中占31.2％，融合蛋白绝大部分是以可溶形式表达的。经Western blot证实，可溶表达的融合蛋白与FMDV阳性血清具有良好的免疫反应性。将可溶表达的融合蛋白用50%Ni-NTA树脂纯化，用融合蛋白作包被抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出口蹄疫阳性血清。     

重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析

鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。     

费氏弧菌β-内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学分析

以费氏弧菌（Vibrio fischeri）EM17基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆了该菌的β-内切葡聚糖酶基因（GenBank Accession Number : EF533943）。将其插入到表达载体pGEX-6p-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达。测序结果经DNAMAN软件分析，该基因与GeneBank中费氏弧菌 ES114基因组预测的β-内切葡聚糖酶基因同源性达到97.1％，但与GeneBank中其他β-内切葡聚糖酶基因同源性较低。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为9.0。同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在 Mg2+，Ca2+对酶有激活作用，Mn2+, Pb2+则严重抑制该酶的活性。