鸡胚精原干细胞定向诱导分化为脂肪细胞的研究

为研究体外定向诱导鸡胚精原干细胞（Spermatogonial stem cells, SSCs）向脂肪细胞分化的能力，取孵化16d的鸡胚睾丸，无菌获取SSCs，体外培养传代。采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂（地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX））诱导SSCs向脂肪细胞分化。结果显示SSCs被诱导7～21d后，分化成脂肪细胞，其中诱导程序⑥的诱导分化效果较好，分化率为85%。诱导剂联合协同作用的诱导效果极显著地(P<0.01)高于单独作用的诱导效果。诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性，并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ。表明鸡胚胎精原干细胞（SSCs）体外培养传代后仍具有多向分化潜能，在特异性化学物质的诱导下，可被定向诱导分化为脂肪细胞。     

自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展

原始生殖细胞（PGCs）是哺乳动物各级生殖细胞的祖细胞。PGCs在体外合适的培养条件下，可自我更新，形成具有ES特征的多能干细胞系，称作胚胎生殖细胞（EG细胞）。EG细胞高度类似于ES细胞，PGCs可作为哺乳动物ES细胞分离克隆的一个有效替代途径，本研究对自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展及其相关问题作一简述。     

鸡胚血液原始生殖细胞的分离纯化及鉴定

家禽的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是形成精子和卵子的前体细胞,可在性成熟的家禽体内生成精子和卵子,因此家禽PGCs可应用于以PGCs为基础的现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域,具有重要的科研与应用价值。本研究使用Nycodenz密度梯度离心法在孵化至13~15期的鸡(Gallus gallus)胚血液中分离纯化鸡胚的PGCs,经显微注射针分拣后,PGCs的纯度可达99%以上,细胞直径主要集中于13~15μm;将所分离纯化的PGCs分别通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、高碘酸希夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色及阶段特异性胚胎表面抗原-1(stagespecific embryonic antigens-1,SSEA-1)免疫化学染色进行鉴定,染色结果均出现PGCs所特有的反应;使用活细胞荧光染料PKH26对分离纯化的PGCs进行标记,成功标记的PGCs在荧光显微镜下可观测到红色荧光,将约200个标记后的PGCs,通过腹主动脉注入孵化至14~16期的受体鸡胚中,在孵化至第8天的鸡胚性腺冷冻切片中,可检测到供体PGCs的存在,这一结果表明,所分离纯化的PGCs可定植于受体鸡胚的性腺中。本研究为以PGCs为基础的种质资源保存研究以及转基因技术研究提供了基础资料。     

从原始生殖细胞分离昆明小鼠EG细胞及其传代培养

为提高昆明小鼠胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)建系效率，以怀孕8.5～12.5 d小鼠胎儿为材料，比较了胎儿后1/3部位的组织共培养、生殖嵴共培养、差速贴壁和穿刺生殖嵴4种分离胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的方法以及不同传代方式对EG细胞克隆的影响。结果表明：生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好分离EG细胞的效果，与其它两组比较差异显著；手工传代方式与连同成纤维细胞一起消化的传代方式相比获得了较高传代比率。对所分离EG细胞经形态观察、AKP染色和体外分化能力检测，证实其符合小鼠EG细胞的集落状生长、细胞未分化特性及细胞多能性等特征。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

鸡FGF8基因RNA干扰载体的构建及其对PGCs形成的影响

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要。为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus)FGF8的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能。根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到p GMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1。以q RT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的sh RNA载体进行慢病毒包装。在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用q RT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率。结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为sh FGF8-1、sh FGF8-2、sh FGF8-3,其中sh FGF8-2干扰效率最佳。将sh FGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×10~(8 )TU/m L、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体。对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4 d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P0.01),PGC标记基因Cvh、C-kit表达极显著上调(P0.01)。此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4 d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH~+PGCs比例显著增加(P0.01)。本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成。     

鸡胚精原干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

研究体外定向诱导鸡胚精原干细胞(spetmatogonial stem cells,SSCs)向脂肪细胞分化的能力.取孵化16 d的鸡(Gallus gallus)胚睾丸,提取SSCs,体外培养和传代.采用不同的诱导程序和不同组合的诱导剂(地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX))诱导SSCs向脂肪细胞分化.结果显示,诱导SSCs7～2l d后,分化成脂肪细胞,其中地塞米松、胰岛素和IBMX联合使用3 d后更换为胰岛素作用l d,经过3次循环后,用胰岛素继续处理至21 d,这一方法的诱导分化效果较好,分化率为85%.高于诱导剂联合协同作用的诱导效果(P<0.01).同时诱导剂联合作用协同作用的诱导效果高于单独作用的诱导效果(P<0.01).诱导的脂肪细胞经特异性的油红O染色为阳性,并高表达脂肪细胞标志基因PPARγ.表明SSCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异性化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞.     

不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖作用的比较

本研究比较了层粘连蛋白(laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、胶原蛋白(collagen)以及睾丸支持细胞(sertoli cell)4种不同培养系统对鸡(Gallus gallus)精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)体外增殖的作用效果。采用三酶两步消化法分离SSCs,细胞经明胶差速纯化后培养,将传至3代的SSCs重新接种于层粘连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白包被的培养皿中以及睾丸支持细胞制备的饲养层上,通过形态学、5-乙基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖、qRT-PCR技术检测不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖的作用效果。结果表明,鸡SSCs的碱性磷酸酶(AKP)阳性克隆数在睾丸支持细胞组最高,达到每视野(32±3)个,层粘连蛋白组、纤维连接蛋白组和胶原蛋白组分别为(26±3)、(24±2)和(23±2)个,三组差异不显著(P0.05);EDU检测睾丸支持细胞组细胞增殖率为(92.82±2.15)%,显著高于三组基质蛋白组(P0.01);qRT-PCR结果显示,增殖标记基因原癌基因(myconcogene,c-myc)、Kruppel样因子4(kruppel-like factor 4,Klf4)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在睾丸支持细胞组的表达量最高,其次为层粘连蛋白组,c-myc和Klf4在纤维连接蛋白组中的表达要高于胶原蛋白组,PCNA则相反。实验结果表明:三组基质蛋白及睾丸支持细胞都能够促进鸡SSCs的体外增殖,其中睾丸支持细胞作用最佳,其次为层粘连蛋白,纤维连接蛋白和胶原蛋白两者作用效果差异不显著。该结果为进一步优化鸡胚SSCs的体外培养体系,阐明生殖细胞增殖机制提供了实验基础和理论支撑。     

梅岭土鸡原始生殖细胞的生物学特性

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。     

家畜多能干细胞的研究现状与应用

多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括从胚胎内细胞团中分离出的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),外胚层干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs),从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离出的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs).这些细胞都具有向各种类型细胞发育的潜能,因此,PSCs为再生医学的发展,人类基因疾病的动物模型的建立,异种器官移植和高质量抗病新品种的培育提供了有效的途径.迄今为止,PSCs在小鼠(Mus musculus)模型和人类物种已经做了大量研究,同时,家畜的ESCs和iPSCs也取得了有效的进展,表明其不仅可以应用于特定家畜优良品性的稳定遗传和优育,而且可以以家畜为载体生产人类需要的化学药品和抗体,甚至应用在人类疾病的临床前应用中.然而,家畜的ESCs相对来说是难分离和富集的,体外培养建立稳定的ESCs系具有更大的难度和挑战.近年来,得益于对家畜ESCs和相关iPSCs相关的持续研究,已初步揭示了家畜ESCs的独特生物学特性.PSCs已经成为生命科学和高科技农业和生物学一个创新的研究领域.在本文中,本文综述了家畜PSCs的发展历程与应用前景.     

小鼠生后不同发育阶段睾丸组织中Crumbs-3(Crb3)的表达

为确定极性调控蛋白Crumbs-3(Crb3)在小鼠(Mus musculus)睾丸组织的定位及其在曲精小管精子发生及间质细胞发育过程中的分布规律,本研究运用常规石蜡切片-HE染色方法和免疫荧光组织化学技术,分别对小鼠生后不同发育阶段睾丸组织结构及Crb3在不同发育时期睾丸组织中的分布进行了研究。结果显示,随着个体发育,曲精小管的直径及生精上皮的厚度不断增大,管腔则由小增大、变小再增大;睾丸曲精小管内生精细胞处于动态的发育变化中,2周龄的生精小管内仅有增殖分裂的数层精原细胞和支持细胞,4周龄时出现各级生精细胞、但无精子形成;之后,继续增殖分裂,至8周管腔内有大量精子形成;并随日龄增加生精细胞密度不断加大;支持细胞的形态随着个体发育逐渐变得清晰而易于辨认;间质细胞则随个体发育体积不断增大、核质比例逐渐下降,而胞质嗜酸性逐渐增强。免疫荧光染色结果显示,Crb3蛋白主要分布在各周龄睾丸曲精小管生精细胞胞膜以及睾丸间质细胞胞膜,且间质细胞上的阳性信号明显强于生精细胞。研究结果提示,Crb3不仅与生精上皮细胞的极性建立和维持有关,而且可能参与睾丸类固醇激素的合成和分泌。     

鸡胚原始生殖细胞体外分化的研究

本文从第19期（孵化68~72h）鸡（Gallus domesticus）生殖嵴分离到原始生殖细胞（PGC），通过PGC-体细胞共培养进行了原代和传代培养，并对PGC做了c-kit免疫组化鉴定。通过改变PGC的体外培养条件，诱导PGC分化成了神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞，并分别通过神经元特异性烯醇化酶（NSE）和角蛋白（keratin）免疫组化进行了分化细胞的鉴定，均呈阳性。结果表明培养的鸡胚PGC在体外可分化成神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。     

仔猪睾丸支持细胞的增殖与发育

为了阐明支持细胞增殖和分化能力对精子生成的影响,本实验以7、21和35d仔猪为材料,利用细胞直接计数、免疫组织化学、流式细胞术和免疫印迹分析了仔猪睾丸支持细胞、生精细胞数量和增殖能力变化以及支持细胞的成熟分化状况。结果:(1)从7～21d,曲细精管中支持细胞与其它细胞之间的界线更加明显;从7～35d,每克睾丸中间质细胞和支持细胞的数量在21d时达到高峰(P<0.05),而生精细胞的数量则一直增加(P<0.05),但并没有在曲细精管中发现圆形精子;(2)从7～35d,支持细胞和间质细胞都能表达GATA-4,支持细胞中GATA-4的累积光密度(IOD)在21d时最高(P<0.05),而间质细胞中的IOD在21d和35d之间没有明显差异(P>0.05);(3)从7～35d,整个睾丸细胞都有增殖能力,睾丸细胞的细胞增殖指数(PI)和S期细胞指数(SPF)在21d时最高(P<0.05);三种细胞在这一时期都能表达PCNA,三种细胞PCNA的IOD值和睾丸中PCNA的表达水平在21d时最高(P<0.05);(4)从7～35d,Connexin 43(Cx43)主要表达于支持细胞的细胞质,支持细胞和间质细胞中的IODs在2...     

仔猪睾丸组织块生精细胞体外培养及鉴定初报

目的：建立仔猪睾丸组织块生精细胞爬片体外培养模型。方法：应用溴脱氧核苷尿嘧啶(5＇-Bromo-2＇-deoxyuridine, BrdU)免疫荧光技术检测生精细胞体外增殖分化情况；采用HE染色鉴定体外培养生精细胞分化程度。结果：结果表明体外培养第3天支持细胞开始游出睾丸组织块并贴壁；体外培养第4～8天睾丸组织块周围可见生精细胞，但未见明显增殖分化情况；体外培养第9～20天可明显观察到生精细胞增殖分化，间桥连接(gap junction)的生精细胞集落呈葡萄串或串珠状，并有精子细胞形成。结论：本培养体系能够提供睾丸组织块生精细胞增殖分化所需要的条件，在没有添加睾酮的情况下能够使非精子细胞分化为精子细胞。     

虚拟制造技术浅谈

虚拟制造技术是近几年发展起来的新技术。通过对虚拟制造技术知识的介绍,阐明了开展虚拟制造技术研究和应用的必要性与重要性。     

太阳辐射减弱对冬小麦叶片光合作用膜脂过氧化及同化物累积的影响

为了探究气溶胶的太阳辐射减弱效应对农作物叶片生理特性及同化物累积的影响,以扬麦13为供试材料,在大田试验条件下系统研究了不同辐射减弱处理（100%、60%、40%、20%、15%）对冬小麦叶片光合作用、膜脂过氧化水平和同化物积累的影响。结果表明：太阳辐射减弱至自然光的60%-15%时,冬小麦叶片净光合速率减少15.8%-70.1%,光合色素的含量（叶绿素a、b和类胡萝卜素）显著提高,其中叶绿素b含量的增加最明显。太阳辐射减弱会抑制冬小麦叶片膜脂过氧化程度,减少细胞膜透性,且辐射减弱的程度越高,影响越大。当太阳辐射为自然光的60%-15%时,冬小麦叶片的可溶性糖含量比对照降低了32.22%-76.45%,可溶性蛋白含量降低了19.02%-48.12%,但总游离氨基酸含量比对照增加了47.46%-177.87%。上述结果表明,太阳辐射减弱后会减弱冬小麦光合作用,增加光合色素含量,抑制膜脂过氧化程度,从而导致作物体内同化物的累积受阻,糖类及蛋白质的含量显著降低,必然会影响作物的产量及品质形成。     

结直肠癌表观遗传学研究进展

近年来,结直肠癌（colorectal cancer,CRC）成为影响人类健康的常见恶性肿瘤之一。目前对CRC发病机制的研究不仅停留在对核基因组的研究,更多集中在表观遗传学对疾病的影响,如DNA的甲基化、组蛋白乙酰化、基因印迹等对疾病发生发展过程的影响。本文主要讲述了CRC的表观遗传学研究进展,旨在探讨表观遗传学在CRC风险预警和治疗中的潜在作用。