水牛胎儿成纤维细胞转染外源基因的初步研究

研究了水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFF）转染外源基因后的细胞生物学特性。纯化含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）和新霉素抗性基因的线性化载体,用脂质体法转染体外培养3代的BFF细胞,应用抗生素G418筛选2周后挑取转基因抗性细胞集落扩大培养。结果发现：经过G418筛选后细胞增殖活力下降,胰蛋白酶消化法共分离获得162个转基因水牛阳性细胞集落,转移到24孔板扩大培养后,132个（85．2％）细胞集落可以存活,转移到4孔板中后仅有52个（32．1％）细胞集落能继续生长,最终能在35mm培养皿中大量培养的只有15个（〈9．3％）。抗性细胞由梭形、成簇生长变为多角形、不规则形弥漫生长,立体感减弱,细胞生长速度减慢,活力下降。染色体核型异常率增加,10个抗性细胞集落核型正常率平均为61％,显著低于对照组86．7％（P〈0．01）。研究结果为建立和优化BFF细胞转染外源基因平台奠定了工作基础。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

供体细胞种类对牛核移植效果的影响

供体细胞种类对牛卵母细胞核移植效果影响的研究结果表明,颗粒细胞的核移植效果与成年牛成纤维细胞无显著差异(19.8%vs 17.3%,P>0.05);胎牛成纤维细胞核移植囊胚发育率高于成年牛成纤维细胞(24.2%vs 14.0%,P<0.05);血清饥饿处理的胎牛成纤维细胞(休眠细胞)与高血清培养(非休眠细胞)的胎牛成纤维细胞核移植效果差异不显著(18.8%vs 18.6%,P>0.05),表明胎牛成纤维细胞血清饥饿处理没有必要。     

鸡FGF8基因RNA干扰载体的构建及其对PGCs形成的影响

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为精细胞的祖细胞,广泛用于研究精子的发生。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)家族对PGCs的形成至关重要。为了探究成纤维生长因子8(FGF8)的具体功能,本研究通过构建家鸡(Gallus domesticus)FGF8的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)慢病毒干扰载体,获得稳定低表达FGF8的鸡胚胎干细胞株,并进一步研究FGF8在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向PGCs分化中的功能。根据家鸡FGF8的转录本设计3个RNA干扰靶点,连接到p GMVL-SC5干扰载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1。以q RT-PCR技术检测各靶点对FGF8的干扰效率,将干扰效率最佳的sh RNA载体进行慢病毒包装。在以慢病毒敲低FGF8的ESCs中进行视黄酸(retinoic acid,RA)诱导,观察各组细胞形态变化,收集不同时间的各组细胞,利用q RT-PCR、间接免疫荧光以及流式细胞术等方法,分析检测生殖相关标记基因的表达变化和PGCs形成效率。结果表明,FGF8慢病毒干扰载体构建成功,分别命名为sh FGF8-1、sh FGF8-2、sh FGF8-3,其中sh FGF8-2干扰效率最佳。将sh FGF8-2进行慢病毒包装,获得滴度为5×10~(8 )TU/m L、干扰效率为(70±4.31)%的慢病毒载体。对于FGF8表达抑制的ESCs,体外RA诱导4 d后,PGC样细胞显著增加,ESC标记基因Nanog表达极显著下调(P0.01),PGC标记基因Cvh、C-kit表达极显著上调(P0.01)。此外,免疫荧光及流式细胞术分析结果也进一步证实,诱导4 d后与对照组比较,FGF8低表达使CVH~+PGCs比例显著增加(P0.01)。本研究成功构建了稳定转染鸡胚胎干细胞的FGF8特异性慢病毒载体,并证实FGF8在体外参与调控PGCs的形成。     

绒山羊成纤维细胞生长因子5基因(FGF5)毛囊特异性表达载体的构建及转染胎儿成纤维细胞

绒山羊的绒毛品质、产量与皮肤毛囊的生长发育密切相关。本研究旨在构建绒山羊(Capra hircus)成纤维细胞生长因子5基因(fibroblast growth factor 5,FGF5)的毛囊特异性表达载体,并证明其表达的有效性。分别以绒山羊基因组和c DNA为模板,利用PCR方法克隆角蛋白关联蛋白6-1(keratin associated protein 6-1,KAP6-1)基因的启动子和FGF5基因的编码区序列(coding sequence,CDS),并将这两个元件连接到去除CMV启动子的真核表达载体p EGFP-N1上,FGF5与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达框之间以猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)2A(P2A)相连,构建毛囊特异性表达载体p EGFP-N1-KF。表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞后,对细胞表达产物进行q RT-PCR和Western blot检测。酶切鉴定结果表明,载体p EGFP-N1-KF构建成功;q RT-PCR结果表明,FGF5正常表达;Western blot结果显示,P2A能够有效剪切FGF5和EGFP融合蛋白。表明成功得到了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体并在绒山羊胎儿成纤维细胞中能正常表达。本实验为进一步研究绒山羊FGF5基因在毛囊发育和周期调控中的作用提供了技术支持。     

转染方法对肌肉生长抑制素基因敲除载体转染效率的影响

本研究主要探讨转染方法对不同细胞系的转染效果。实验采用电穿孔和脂质体转染方法，将线性化的绵羊肌肉生长抑制素基因（myostatin）药物正负筛选（PNS）打靶载体pLoxp-1．4K-4．3KDNA导人体外培养的绵羊胎儿和成年绵羊耳部成纤维细胞中，而后采用G418和GANC进行药物抗性细胞克隆筛选和培养。结果发现，脂质体法对myostatin基因敲除载体的转染效果明显优于电击法，但电穿孔法对细胞类型的依赖性较小；采用与载体基因型相同的细胞系，两种转染方法的转染效率均略高于对照成年绵羊成纤维细胞系。     

黄连提取物对小鼠胸腺细胞凋亡的影响

采用光学显微镜法、透射电镜法、原位末端标记法和琼脂凝胶电泳方法观察黄连(RH IZOM ACOPT ID IS)提取物对地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的影响。空白对照组的胸腺细胞核染色质分布和形态学特征正常,凋亡对照组胸腺细胞数量显著减少,黄连提取物组胸腺细胞与空白对照组相比无明显变化。原位末端标记显示凋亡对照组原位末端标记(TUNEL)阳性细胞数目多,凋亡指数为0.30±0.10,而空白对照组和黄连提取物组很少见TUNEL阳性细胞,凋亡指数仅为0.02±0.004和0.01±0.004。琼脂凝胶电泳显示凋亡对照组出现了典型的“梯状”条带,空白对照组和黄连提取物组未见梯状带。结果表明黄连提取物对地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡有抑制作用。     

Scriptaid处理牦牛成纤维细胞对组蛋白乙酰化及重编程的影响

供体细胞的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因。本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对牦牛(Bos grunniens)成纤维细胞重编程的影响,以及Scriptaid处理供体细胞对牦牛-黄牛(Bos taurus)异种核移植(interspecies somatic cell nuclear transfer,iSCNT)胚胎体外发育的影响。分别利用0、500、1000、1500和3000nmol/LScriptaid处理牦牛胎儿成纤维细胞,观察细胞形态、统计细胞活率、测定细胞周期、检测组蛋白乙酰化水平,并以处理后的成纤维细胞进行体细胞核移植,检测重构胚体外发育水平。结果显示,经Scriptaid处理24h后,细胞形态发生了改变,细胞增殖受到明显抑制,大量细胞被阻滞在G0/G1期;随着Scriptaid处理浓度的增加,细胞组蛋白H3K9ac乙酰化水平逐渐提高;以1000nmol/L Scriptaid处理的成纤维细胞作为供体细胞后的囊胚率显著高于其他组(P<0.05)。研究结果表明,Scriptaid能显著提高牦牛成纤维细胞的乙酰化水平,以1000nmol/L Scriptaid处理供体细胞显著提高了牦牛-黄牛异种克隆胚胎的体外发育。本研究初步证实Scriptaid是通过提高成纤维细胞的乙酰化水平来促进核的重编程,为研究供体细胞的重编程以及异种克隆牦牛提供理论依据。     

供体细胞不同来源和处理方式对牦牛异种克隆胚胎发育的影响

本文以黄牛卵母细胞胞质为受体,牦牛耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对牦牛异种克隆胚胎发育的影响。结果显示：雄性供体细胞的牦牛异种克隆囊胚发育率显著高于雌性供体细胞（56.6% vs 39.5％,P﹤0.05）,但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对牦牛异种克隆胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻后解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组（54.5％ vs 78.2％,P﹤0.05）,但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异。说明供体细胞的性别对牦牛异种克隆囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对牦牛异种克隆囊胚发育影响很少。     

凋亡相关基因PDCD5的表达与桥本甲状腺炎临床相关性的研究

本实验旨在探明程序性死亡因子5（programmed cell death 5,PDCD5）在桥本甲状腺炎（hashimoto＇s thyroiditis,HT）病程中的表达,并研究其与HT疾病发生发展之间的关系。以β-actin基因、β-actin蛋白为内参照,采用RT-PCR法和Western印迹法检测60例HT患者和40例健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）PDCD5 mRNA和蛋白的表达水平。以外周血血清中抗甲状腺微粒体抗体（TMAb）水平45%为标准,划分为低TMAb组（TMAb≤45%）和高TMAb组（TMAb〉45%）,比较两组患者的血清TGAb值、甲状腺激素水平及PDCD5的表达水平。结果表明,与健康对照组相比较HT患者PDCD5 mRNA和PDCD5蛋白的表达阳性率和相对表达水平显著升高（p〈0.05）,在高TMAb水平组PDCD5的表达更高,较低TMAb水平组有显著性差异（p〈0.05）,TGAb水平显著高于低TMAb组（p〈0.01）,血清TT3、TT4、FT3、FT4没有统计学差异（p〉0.05）。由于PDCD5的表达量在HT患者PBMC中上调,并且随病情加重其表达量逐渐增加,初步判定在HT疾病的发生发展过程中,PDCD5具有重要意义。     

贵州本地山羊STAT5A基因多态性及其与生长性状关联分析

本研究通过探讨STAT5A基因SNP与山羊生长性状关联性,旨在为山羊选种选育提供更好的科学依据。实验以贵州白山羊和贵州黑山羊为研究对象,采用DNA池法及PCR-SSCP技术检测STAT5A基因单核苷酸多态性。结果发现,在贵州白山羊和贵州黑山羊STAT5A基因内含子10均检测到1个SNP位点G127A,表现为3种基因型,分别命名为GG、GA和AA。基因型与生长性状关联分析显示,贵州黑山羊基因型GA个体的胸围和体重指标显著高于基因型GG个体（p〈0.05）,而其余3个指标均差异不显著（p〉0.05）;贵州白山羊基因型GA个体的体斜长、胸围和管围指标显著高于基因型GG个体（p〈0.05）,而其余指标均差异不显著（p〉0.05）。研究结果提示：STAT5A基因可能是影响山羊体重、体斜长、管围和胸围的主效基因或与主效基因连锁,G127A位点可望作为提高山羊个体生长性状的分子遗传标记。     

鸭ChREBP基因多态性与血清生化指标关联性分析

鸭ChREBP（carbohydrate response element binding protein,碳水化合物反应元件结合蛋白）,是鸭糖酵解脂肪酸从头合成的重要调节因子之一,对调节机体糖脂代谢平衡有重要作用;本研究以PCR-SSCP结合直接测序对三穗鸭、兴义鸭、樱桃谷鸭3个鸭品种ChREBP基因外显子1、2、3、6、9、10、11、12、13进行多态性检测,分析SNPs位点与血清生化指标的关联性及对各指标的加、显性效应;结果显示,仅在樱桃谷鸭的外显子9中检测到了g.246911 G〉A突变,表明鸭ChREBP基因具有良好的保守性,产生了AA、AB、BB三种基因型,A和B两个等位因,B和BB分别为该位点的优势等位基因和优势基因型,其频率为0.575和0.450,多态信息含量（PIC）为0.369,属于中度多态,卡方（χ^2）检验发现,该g.246911G〉A突变位点的基因型分布在樱桃谷鸭群体中严重偏离了Hardy-Weinberg平衡,可能是因为长期人工选择的原因,关联性分析结果表明,AA基因型个体的血清生化指标除低密度脂蛋白没有达到显著水平外,其他指标均显著地高于BB基因型个体（p〈0.05）,加、显性效应显示,该位点对总蛋白、白蛋白、球蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、总胆固醇具有显著的加性效应（p〈0.05）,对总蛋白和白蛋白有显著的负显性效应（p〈0.05）;推测g.246911G〉A为有利突变,AA和A分别为有利基因型和等位基因,可作为今后选育优秀生长性状樱桃谷鸭的遗传标记位点。     

日粮电解质平衡对肉鸡生产性能和血液生理生化指标的影响

本试验研究不同的日粮电解质平衡值（dEB值）对银香麻鸡生产性能和血液理化指标的影响。结果表明：（1）第一个阶段（小鸡阶段）,对于日增重而言,日粮中适宜的dEB值范围为50～300 mmol/kg,其中以200 mmol/kg为最佳;第二个阶段（大鸡阶段）,日增重较好的dEB值范围为150～300 mmol/kg,其中以250 mmol/kg为最佳。（2）在日粮中添加NaHCO3和CaCl2来调节dEB值时,对于血清中的各种无机成分（钠、钾、氯、钙、磷、HCO3^-）的浓度都有不同程度的改变,但并未引起血清中相应的Na^＋、HCO3^-、Ca^2＋和Cl^-的含量发生正相关的变化。不同的dEB值对血清pH值也无显著影响（P〉0.05）。     

3种玻璃化冷冻液对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后体外发育的影响

本试验主要探索了3种玻璃化冷冻液对水牛MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后体外发育的影响。水牛MⅡ期卵母细胞经3组玻璃化冷冻液（Ⅰ：20％乙二醇（EG）＋20％二甲基亚砜（DMSO）;Ⅱ：20％EG＋20％丙二醇（PROH）;Ⅲ：20％EG＋20％PROH＋10％DMSO）毒性试验后,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组体外受精的分裂率、8-细胞率和囊胚率之间差异不显著（P〉0．05）,分裂率均显著低于对照组（P〈0．05）,但Ⅱ组8-细胞以后的发育潜力跟对照组无显著差异（P〉0．05）。进一步比较了3组玻璃化冷冻液对卵母细胞的玻璃化冷冻效果。卵子解冻后进行体外受精后,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的发育潜力均显著低于对照组fP〈0．05）,各组的8一细胞率和囊胚率之间无显著差异（P〉0．05）,但Ⅱ组卵裂率明显高于Ⅰ组（24．8±4．6％VS12．7±1．5％,P〈0．05）。结果表明,3种冷冻玻璃化保护液均可用于冷冻水牛MⅡ期卵母细胞,其中Ⅱ组处理的卵母细胞体外受精效果相对较好。     

绵羊X染色体59194976位点多态分析及其与尾（臀）脂性状相关性研究

尾脂沉积能力在脂尾型绵羊和瘦尾型绵羊问存在很大的差异,但其沉积脂肪的遗传特性与分子机制仍不明晰。为此,本研究选择尾型极端差异的阿勒泰羊（巨型脂臀）、湖羊（短脂尾）和黑萨福克羊（长瘦尾）,采用PCR-RFLP方法检测绵羊X染色体59194976位点多态性,分析其与尾（臀）脂沉积能力的相关性。结果表明：在阿勒泰羊群体中G等位基因属优势等位基因,其两等位基因比值（G／A）分别是湖羊和黑萨福克羊的6倍和68倍,且G等位基因在阿勒泰羊中趋于纯合。卡方检验结果表明,阿勒泰羊在该位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（p〉0．05）,而湖羊和黑萨福克羊在该位点均处于Hardy-Weinberg极不平衡状态（p〈0．01）。以上结果提示,绵羊x染色体59194976位点SNP可作为理想的分子标记应用于高、低脂绵羊品种选育。     

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究

采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。     

华北平原冬小麦/夏玉米轮作田能量闭合状况分析

对华北平原冬小麦/夏玉米轮作田连续3a(2003-11-2006-10)涡度相关观测的能量闭合状况进行综合分析,并探讨下垫面对能量闭合程度的影响.结果表明,能量平衡比率(EBR)日变化规律明显,以昼夜交替时波动最大,下午略高于上午,白天能量闭合状况明显优于夜间.将湍流能的相位提前0.5h,湍流通量和有效能的匹配度及能量闭合程度均得到提高.白天EBR呈秋冬高(分别为0.98和0.94)、春夏低(分别为0.85和0.70)的季节变化特征,EBR的波动幅度依次为:夏＞秋＞冬＞春.下垫面状况对地表能量闭合程度影响显著,裸地阶段、小麦季和玉米季的年均白天EBR分别为1.11、0.94和0.74,小麦季的能量闭合状况优于玉米季;EBR波动幅度依次为:裸地阶段＞玉米季＞小麦季.观测期间,白天EBR年均值范围在0.82 ～0.97,平均0.89,较好地满足了农田通量观测对数据质量的要求.     

春玉米田施用双氰胺和硫包衣尿素的节本减排效果分析

氧化亚氮（N2O）是一种重要的温室气体,农田土壤是其重要的排放源.本研究利用温室气体自动测定系统,对华北平原春玉米农田尿素（U）、尿素添加10％双氰胺（DCD1）、尿素添加5％双氰胺（DCD2）、硫包衣尿素（SCU）和不施肥（CK）5个不同施肥处理土壤进行N2O测定,以分析双氰胺和硫包衣尿素对土壤N2O排放的影响.结果表明,（1）各处理N2O排放总量顺序为U＞SCU＞ DCD2＞DCD1＞CK,各处理的排放系数在0.20％ ～0.71％,与单施尿素相比,DCD1、DCD2分别减少N2O排放59.5％、47.1％,硫包衣处理的N2O排放与尿素处理差异不显著,但两者的N2O排放均极显著高于添加DCD的处理（P＜0.01）.（2）排放高峰是伴随土壤孔隙含水量（WFPS）明显上升而发生的,各施肥处理N2O的排放通量与土壤WFPS呈极显著相关关系（P＜0.01）.（3） DCD2施肥方案每减排1tCO2-eq的同时可减少支出约178元,表明此方案可作为减少春玉米农田N2O排放的技术措施.