基于核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列鉴定四季青及其近缘种和混伪品

中药材四季青(Ilicis Chinensis Folium)的基原植物冬青(Ilex chinensis)是重要的园林观赏物种。利用DNA条形码技术可以快速、准确鉴定四季青及其近缘种和混伪品。本研究以冬青、铁冬青(Ilex rotunda)、秤星树(Ilex asprella)、枸骨(Ilex cornuta)和女贞(Ligustrum lucium)等37份植物样本为实验材料,提取全基因组DNA,扩增核糖体DNA第二内部转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列并进行双向测序。测序结果利用Codon Code Aligner 4.2.7进行序列拼接,获得高质量ITS2序列。同时从Gen Bank中获得28条冬青的同属近缘种以及混伪品女贞、四川山矾(Symplocos setchuensis)的ITS2序列。基于隐马尔科夫模型(hidden Markov model,HMM)注释5.8S和28S,获得完整的ITS2区域,进而应用MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)进行冬青种间和种内序列分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ tree)。结果表明,琼脂糖凝胶电泳得到清晰明亮的均一条带,说明利用通用的ITS2引物可以成功扩增到用于测序的PCR产物。通过PCR产物测序、数据处理和序列分析可知,冬青种内ITS2长度经过比对后为239 bp,全部样品的种间ITS2比对后长度为269 bp。冬青种内有4个变异位点以及6个单倍型,种间有143个变异位点,远远多于其种内变异位点。MEGA6.0分析结果表明,种间最小K2P遗传距离(0.094)大于种内最大K2P遗传距离(0.013)。邻接树显示,女贞和四川山矾分别以100%的自展支持率分别聚类,表现出良好的单系性,冬青属物种聚为一大支。冬青在冬青属下可以单独聚为一支,可以进行区分。冬青属其他物种以同一亚属聚为一支。研究结果表明,作为一种快速、准确、简便的分子生物学鉴定方法,ITS2可以应用于冬青及其近缘种和混伪品的鉴定,同时对于准确鉴定冬青属物种亦有巨大潜力,可为冬青属植物在临床上的用药安全和开发应用提供科学依据。     

EST-SSR分析云南茶树资源的遗传多样性和亲缘关系

利用EST-SSR标记对云南134份茶树资源遗传多样性和亲缘关系进行了分析。30对引物共检测到等位位点127个,平均每对引物产生423个;共检测到263个基因型,平均每对引物所扩增的基因型有88个;遗传多态性信息含量平均达0501,高于其它地区的相关研究结果,表明云南茶树资源具有丰富的遗传多样性。资源间的平均遗传距离和相似系数分别为0413和0597,说明资源间的遗传差异比较大,遗传基础较宽。聚类可将134份资源划分为4大组。8个种群间的遗传相似系数变异范围为0753～0981,平均遗传相似系数为0891,表明不同种群间的遗传差异比较小。云南茶树资源间亲缘关系的揭示为今后茶树资源保存和新品种选育提供了一定理论依据。     

利用SRAP和ISSR标记分析广东茶树种质资源的遗传多样性

利用EST-SSR标记对云南134份茶树资源遗传多样性和亲缘关系进行了分析。30对引物共检测到等位位点127个,平均每对引物产生423个;共检测到263个基因型,平均每对引物所扩增的基因型有88个;遗传多态性信息含量平均达0501,高于其它地区的相关研究结果,表明云南茶树资源具有丰富的遗传多样性。资源间的平均遗传距离和相似系数分别为0413和0597,说明资源间的遗传差异比较大,遗传基础较宽。聚类可将134份资源划分为4大组。8个种群间的遗传相似系数变异范围为0753～0981,平均遗传相似系数为0891,表明不同种群间的遗传差异比较小。云南茶树资源间亲缘关系的揭示为今后茶树资源保存和新品种选育提供了一定理论依据。     

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基基因(COⅡ)序列的不同地理种群桃蛀螟的系统发育研究

桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)是一种食性杂,为害十分严重的害虫,近年来发现其对玉米的为害呈加重趋势.为了揭示桃蛀螟不同地理种群内及种群间的遗传分化和系统发育关系,本研究对来自我国广西、广东、四川、浙江、山东、河北、河南、北京和辽宁等省(市、区)的24个地理种群622头桃蛀螟个体的线粒体细胞色素C氧化酶Ⅱ亚基基因(COⅡ)片段(648 bp)进行了序列分析,共有51个变异位点,变异位点占分析总位点数的7.87％,形成了53种不同的单倍型(GenBank登录号为JQ363873～JQ363922).在桃蛀螟COⅡ基因片段的核苷酸序列中,A+T平均含量为75.32％,表现明显的A/T偏倚性.24个地理种群的平均基因流(Nm)为1.09,总群体的固定系数(Fst)为0.18629,表明我国桃蛀螟总群体产生了一定程度的遗传分化.北方和东部(Fst=0.01197)和西南地区(Fst=0.0133)遗传分化系数较小,而南方地区(Fst=0.24381)种群内部的遗传分化系数较大,基因流也呈现相对应的结果(北方和东部地区Nm=41.58,西南地区Nm=118.90,南方地区Nm=0.99),表明南方地区桃蛀螟的遗传分化程度明显大于北方和东部以及西南地区.对53种单倍型用邻接法构建系统发育树和单倍型网络结构关系图,结果发现,南方地区广东和广西的桃蛀螟和其他地区不同寄主上的桃蛀螟之间存在比较明显的遗传分化,而其他地区桃蛀螟单倍型与地理种群之间没有明显的对应关系;AMOVA分子方差分析结果表明,中国桃蛀螟的遗传分化主要来自种群内部(89.99％);对其群体进行核苷酸错配分布分析,并对地理种群的历史发生动态进行Tajima's D和Fu's Fs test中性检测,结果发现,群体核苷酸错配分布呈现一个不平滑的单蜂,并且桃蛀螟种群Taijima's D为负值(-2.5776),且达到显著水平,Fu's Fs值是绝对值很大的负值(-112.603),结果证明,桃蛀螟种群在演化历史中发生过种群扩张,并且扩张时间久远,发生在至今大约46700～116800年以前.     

孑遗植物中华桫椤2个群体遗传多样性的ISSR分析

为阐明小尺度范围内濒危物种孑遗植物中华桫椤种群的遗传多样性,保护和恢复种质资源,本文采用ISSR分子标记技术对云南屏边大围山的大围山红旗水库和大围山山谷2个中华桫椤种群的遗传多样性进行分析。结果表明用从100个随机引物中筛选出的20个能高产稳定扩增的ISSR引物对2个群体共57个样品进行扩增,共获得132个可分析位点,其中大围山红旗水库的多态性位点83个,占62.87%,而大围山山谷的多态性位点97个,多态位点百分率（P）为73.48%,两者Nei＇s基因多样性分别为0.2614和0.2832,Shannon＇s信息指数分别为0.3762和0.4135,两个种群的遗传分化系数Gst为0.0701,分析结果表明中华桫椤种群内的遗传多样性较高,但两种群间的遗传分化不明显。本研究结果将对中华桫椤自然群体的保育和管理具有重要意义。     

细基江蓠繁枝变种（Gracilaria tenuistipitata var.Liui）群体遗传多样性的ISSR分析

运用ISSR标记对来自深圳、北海和防城港的三个细基江蓠繁枝变种群体进行遗传多样性检测,筛选出的16条ISSR引物共扩增出111条带,引物平均多态位点比例为54.95%。三个群体的多态位点比例深圳群体最高为23.42%,北海群体最低为4.50%;群体平均多态位点比例为11.12%,平均基因多样性（Hs）为0.051 3,表明细基江蓠繁枝变种群体遗传多样性较低。群体遗传分化指数为0.756 5,说明遗传变异主要存在于群体间且群体间的遗传分化水平较高。Mantel检验发现遗传距离与地理距离无关。适应生态环境选择无性繁殖模式可能是细基江蓠繁枝变种群体遗传多样性较低、群体间遗传分化大的重要因素。     

绿色豌豆蚜不同地理种群的遗传多样性

豌豆蚜是我国苜蓿上危害最为严重的害虫之一。利用微卫星标记研究了我国绿色型豌豆蚜10个地理种群的遗传相似性、基因分化、遗传距离与地理距离和海拔之间的关系及其基因结构。选取15对引物扩增300个个体,共检测到41个多态性条带,多态性条带百分率(PPB)为100%。10个豌豆蚜地理种群观测等位基因数(Na)为1.592 7,有效等位基因数(Ne)为1.356 9,Nei’s基因多样性指数为0.206 6,Shannon-Wiener指数(I)为0.307 6。新疆维吾尔自治区、陕西省、河南省种群的遗传多样性较高,内蒙古自治区、山东省、青海省种群相对较低。然而,10个地理种群豌豆蚜(绿色型)的遗传分化较高(Gst=0.399 6)。种群聚类分析结果显示,全部豌豆蚜种群明显聚为两大类群,山东省、河南省种群为一大类群,其余为另一大类群。Mentel检测表明,遗传分化与地理距离、海拔无显著相关性。我国豌豆蚜种群具有非常丰富的遗传多样性,应加强豌豆蚜的监测和治理。     

湖南典型茶树地理种群遗传多样性研究

本文利用RAPD分子标记技术，对4个湖南典型茶树地理种群的240个单株的遗传多样性、种群内和种群间的遗传变异进行研究，结果表明：21个10碱基随机引物共检测到226条谱带，其中多态性谱带为201条，占88.9%。遗传多样性分析结果显示：Shannon's多样性指数为0.43，74.7%的变异分布于群体内，而种群间变异占了25.3%；Nei's指数群体总基因多样度(HT)为0.37，群体内平均基因多样度(HS)0.28，群体间的基因多样度(HST)0.09，群体Nei's基因分化系数（GST）为0.23，说明76.7%的变异存在于种群间，群体内的变异占了总变异的23.3%，与Shannon's多样性指数相比基本一致，均表明种群内有较丰富的遗传变异；种群间的基因流（Nm）为0.74，显示种群间的基因交流有限。     

利用微卫星DNA分子标记分析中华绒螯蟹养殖群体遗传分化

养殖河蟹苗种来自各繁育场,经过繁育场多年封闭或半封闭繁育后河蟹多样性是否降低?本研究以长江水系天然群体为对照,利用微卫星分子标记分析中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)江苏兴化、安徽宣城、辽宁盘锦养殖群体遗传分化。结果表明,4个群体平均有效等位基因数(Ne)分别为9.03、8.77和6.94、8.71;平均观测杂合度(Ho)为0.70～0.75;平均期望杂合度(He)为0.87～0.90;微卫星位点平均多态信息含量(PIC)介于0.84～0.87之间,呈现高度多态性;长江水系天然群体遗传多样性水平高于养殖群体。遗传分化系数F-统计量(FST)介于0.0123～0.0207(FST<0.05);分子方差分析(AMOVA)显示,大部分遗传变异(为98.64%)存在于个体间,少部分变异(为1.36%)存在于群体间。群体间FST和AMOVA分析说明,4个群体处于低等遗传分化水平,除安徽宣城群体与辽宁盘锦养殖群体间遗传分化不显著(P>0.05),其他群体间遗传分化极显著(P<0.01)。基于DA遗传距离构建NJ聚类发现安徽宣城养殖群体与辽宁盘锦养殖群体聚为一支,江苏兴化养殖群体与长江水系天然群体聚为另一支。结构分析107份参试中华绒螯蟹样本被分为二个种群,江苏兴化养殖群体与长江水系天然群体属同一种群,安徽宣城养殖群体与辽宁盘锦养殖群体为另一种群。研究显示,中华绒螯蟹养殖群体具有较高的遗传多样性水平,遗传分化水平低,具有新品种选育的利用价值。     

湖南典型茶树地理种群遗传多样性

利用RAPD分子标记技术,对湖南典型茶树安化云台山种(Camellia sinensis var.sinensis)、城步峒茶(C.sinensis var.assamica cv.Duntsa)、汝城白毛茶(C.ptilophylla)和江华苦茶(C.sinensis var.assamica cv.Jianghua)4个地理种群的240个单株的遗传多样性、种群内和种群间的遗传变异进行了研究。结果表明,21个10碱基随机引物共检测到226条谱带,其中多态性谱带为201条,占88.9%。遗传多样性分析结果显示:Shannon's多样性指数为0.43,种群内变异占74.7%,而种群间变异占25.3%;Nei's指数群体总基因多样性(HT)为0.37,群体内平均基因多样性(HS)为0.28,群体间的基因多样性(HST)为0.09,群体Nei's基因分化系数(GST)为0.23,说明76.7%的变异存在于种群间,群体内的变异占了总变异的23.3%,与Shannon's多样性指数相比基本一致,均表明种群内有较丰富的遗传变异;种群间的基因流(Nm)为0.74,显示种群间的基因交流有限。     

藏绵羊DRB3基因第2外显子多态性分析

为了研究藏绵羊(Ovis aries)DRB3基因的多态性,确定其等位基因数、等位基因间的核苷酸多态位点、变异类型,以及分析各等位基因间的遗传关系和进化意义,研究采用PCR-SSCP方法检测了500只藏绵羊DRB3基因第2外显子的多态性,并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因.结果表明藏绵羊DRB3基因第2外显子表现了37个等位基因,37个单倍型序列分析发现82个核苷酸多态位点;37个单倍型序列与GenBank下载序列对比分析,结果表明35个DRB3的等位基因是本研究旨次发现;37个DRB3基因外显子2的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势.研究认为藏绵羊DRB3基因第2外显子具有丰富的遗传多态性;藏绵羊DRB3基因最初是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因的.     

基于线粒体COII-LrRNA基因对肾形肾状线虫种内群体的遗传多样性分析

肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)是一种植物半内寄生线虫,分布于世界的热带和亚热带地区,是许多蔬菜和热带果树重要的病原线虫.为明确该线虫种内群体的遗传变异,本研究采用序列分析法,对采自浙江(ZJ)、福建(FJ)和重庆(CQ)3个地区的肾形肾状线虫的线粒体COII-LrRNA基因序列进行比较.结果表明,肾形肾状线虫线粒体COII-LrRNA基因片段序列为557～563 bp,AT含量为85.5％,明显高于GC含量.序列分析所得3个群体总的变异位点数、单倍型数、单倍型多样性指数(haplotype diversity,Hd)和核苷酸多样性指数(nucleotide diversity,π)分别为176、40、0.946和0.157 4.分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA)结果显示,这3个肾形肾状线虫群体间遗传分化系数为0.058 15,遗传分化程度中等,没有明显的地理隔离.遗传变异结果显示,94.18％的变异来自群体内个体间,只有5.82％的变异发生在群体间.结果说明,我国肾形肾状线虫种群内COII-LrRNA基因序列变异较明显,具有丰富的遗传多样性,且对环境变化的适应能力较强.研究结果丰富了我国肾形肾状线虫的系统发育信息,为肾形肾状线虫危害植物的内在遗传因素的研究提供了资料.     

湖北乌羊与3个地缘邻近山羊品种间的遗传趋异性研究

本研究以波尔山羊(Capra hircus)为外缘,研究湖北乌羊与地缘邻近的酉州乌羊、麻城黑山羊、南江黄羊3个山羊品种间的遗传分化程度及基因流动情况。利用14对单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)位点对5个品种的基因杂合度(allele heterozygosity,h)、香农指数(Shannon-Weiner index,S)和有效等位基因数(the efficient allelic number,Ne)等反映群体遗传多样性的数据进行分析;通过分析湖北乌羊与其他3个地方山羊品种的基因流动(Nm)、遗传分化(genetic differentiation)情况,研究遗传分化和地理距离(D)之间的关系,并利用遗传距离(Ds)构建5个山羊群体的聚类图。结果表明,在5个山羊品种中,湖北乌羊具有最高的遗传多样性,与其他4个品种间的Nm大小在1.571 6~3.178 7之间,表明基因流动较大;群体间分化系数(Fst)在0.072 9~0.137 2之间,呈中度分化。非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)构建的聚类图表明,湖北乌羊与其地缘临近的3个品种间存在较大的遗传分化而自成一支。研究还发现,湖北乌羊与其他3个地方品种间的标准遗传距离与地理距离间存在相关(r=0.934),遗传分化程度与地理距离存在直线相关性。研究结果提示,湖北乌羊与其地地缘临近的3个品种间仍存在较大的遗传分化,且遗传变异丰富,但该种群的快速扩散使其与其他品种间有着较大的基因流动,因此有必要采取保种措施以防止该种质遗传资源被杂交、稀释而丢失。本研究结果为湖北乌羊的保护和选育工作提供了参考依据。     

藏绵羊MHC-DRB1基因第3外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

为了研究藏绵羊DRB1基因第3外显子多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、变异类型和各等位基因间的遗传关系,本研究采用PCR-SSCP方法,分析了500只藏绵羊(Ovis aries)DRB1基因第3外显子多态性,并对不同等位基因进行克隆和测序。结果表明,藏绵羊DRB1基因第3外显子表现了8个等位基因,8个单倍型序列分析发现了15个核苷酸多态位点,与GenBank序列对比分析,有7个DRB1的等位基因是首次发现。8个DRB1第3外显子的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势。3个种群藏绵羊中B均为优势等位基因,该位点PIC>0.5,为高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。研究认为,藏绵羊DRB1基因第3外显子具有丰富的多态性;藏绵羊DRB1基因最初是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因。     

基于ITS和RLKs序列的苦荞种质资源遗传多样性分析

为明确苦荞资源的遗传多样性水平及遗传关系,对45份苦荞地方品种的ITS和RLKs序列进行基因测序和序列比较分析。结果显示,苦荞ITS和RLKs扩增序列较为保守,基因多态位点数分别占10.6%和7.7%。云贵川地区苦荞材料的遗传多样性最丰富,陕西、山西及宁夏地区次之,甘肃及内蒙古地区最低。四川和贵州地区的苦荞品种均能够单独聚为一类,基于ITS序列构建的NJ树中,陕西地区以北的苦荞品种未形成明显的分支,而云南地区的苦荞穿插在不同的分支中;基于RLKs基因构建的NJ树中,同一地区的苦荞材料较为明显地形成地域聚类,但自展值均较低。     

鲤鱼品系的部分线粒体序列的遗传变异

运用PCR测序法,以9个我国常见鲤鱼（Cyprinus carpio）养殖品种和2个野生群体为研究材料,分析线粒体DNA的16S rRNA、Cyt b和D-loop序列片段,用于分析的序列共有1 457 个位点,其中变异位点32个,简约信息位点21个,共有单倍型16个。分别利用以上3个基因片段以及合并后的序列, 构建NJ和MP进化树。由不同方法获得相似的进化树,由不同基因片段得到的进化树均为两支,其中贝尔湖野鲤（BE）单独成支,其它群体聚为1支,只是由D-loop得到的进化关系更为详细,而由合并后的序列构建的进化树也与利用不同基因序列所得到的进化树并不矛盾。各品系间的分化时间约为3.03×104～1.21×105年前。根据序列的特征,16S rRNA的1个变异位点、Cyt b基因的4个变异位点和D-loop的14个变异位点可以作为鉴定不同的养殖品系和野生群体的SNP,证明mtDNA序列分析可以应用于品系的鉴定。     

橘小实蝇不育雄虫与野生雄虫间遗传分化

对橘小实蝇不育雄虫和福建7个不同地区的野生雄虫共37个个体的线粒体细胞色素氧化酶I（mtDNA COI）基因进行了部分序列测定。在获得的650bp序列中,共有72个变异位点、32个单倍型,其中共享单倍型3种;对所有单倍型聚类分析发现,单倍型在系统树中的分布散乱,没有显示出明显的地理分布族群;结合遗传变异指数（Fst）和净遗传距离（Da）分析认为橘小实蝇不育雄虫与野生虫源间、不同来源的野生虫源间已存有一定程度的遗传分化,但分化程度较低。研究认为应用昆虫不育技术防治橘小实蝇,在饲养过程中需针对不同防治区引进野生虫源复壮,以确保不育雄虫和野生虫源相匹配,提高防治效果。     

EST-SSRs检测油菜（Brassica napus）亲本遗传多样性

油菜EST-SSRs是从油菜ESTs序列（表达序列标签）中开发的一种新型SSR 标记。这种新型分子标记来源于表达基因, 将其用于油菜遗传研究可直接反映相关基因在不同油菜品种间的表达差异。本研究采用21对油菜EST-SSRs标记检测了42个油菜品种（系）的遗传多样性。这些油菜EST-SSRs引物均可获得清晰的产物, 共检测到85个等位位点, 其中有49个等位变异, 占了总检测位点的57.65%。应用NTSYS 软件的聚类方法分析, 结果表明：42份材料遗传距离范围为0.0087-0.1885, 在遗传距离0.1508下, 可把份材料分为 5 组, 基本反映了品种（系）的地源差异。     

江苏省地方鸡品种线粒体DNA遗传多样性分析

江苏省拥有众多优良的地方鸡(Gallus gallus domesticus)遗传资源。这些地方鸡品种经过长期选育,具有肉质好、抗病力强和适应性好等优点,是进行杂交改良的优良素材。为研究江苏省地方鸡遗传资源的群体结构和遗传多样性,本研究对黑狼山、白狼山、鹿苑、溧阳和太湖等5个江苏省地方鸡品种149个个体的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)控制区(displacement loop, D-loop)全序列进行了PCR扩增和测序。结果表明,5个地方品种mtDNA D-loop区全长为1 231或1 232 bp,共计检测到核苷酸变异位点33个,定义了19个单倍型。总体单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.862±0.017和0.005 91±0.00135。中介网络图分析显示,江苏省地方品种含有A、B、C、D和E共5个分支(单倍型群),其中A和B分支为优势分支。分子方差(analysis of molecular variance, AMOVA)分析表明,群体内变异占66.5%,群体间变异占33.5%,5个群体间的固定指数F统计量(F-statistics, Fst)为0.334 97(P0.01)。上述结果揭示,江苏地方品种具有相对较低的遗传多样性,可能有5个母系来源,品种间分化不明显,少数群体可能受到了外来高产系的侵入。该研究结果为江苏地方鸡遗传资源的保护、开发及利用提供了遗传背景信息。     

基于ITS序列和RAMS标记分析青枯雷尔氏菌的遗传多样性*

应用ITS序列和RAMS技术对福建省不同地域,不同寄主作物的青枯雷尔氏菌进行遗传多样性研究。结果表明,供试的21株青枯雷尔氏菌的ITS区序列有3种类型,这3种类型菌株的ITS序列只有1-2个碱基的差异,与参比菌株GMI1000的ITS区序列或者相同或者有1-2个碱基的差异。在此基础上,利用RAMS技术进一步分析表明,供试的青枯雷尔氏菌及参比菌株GMI1000的基因组DNA间存在丰富的多态性。聚类结果显示,供试菌株可聚为3个类群,同一寄主作物的菌株聚在同一类群中,同一地理来源的菌株聚在同一亚类群中,说明青枯雷尔氏菌的遗传分化与寄主作物和地理来源都存在相关性,与寄主作物的关系更密切。