禽类基因工程重组干扰素研究进展

近年来 ,多种禽类干扰素基因已被克隆和在大肠杆菌中表达。禽类基因工程重组干扰素在抗马立克病毒、劳斯肉瘤病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒方面效果显著 ,展现出了广阔的应用前景。文章对禽类基因工程重组干扰素的研究进展作了综述     

重组鸡α-干扰素的表达及其生物活性的初步研究

为获得重组鸡α-干扰素并对其进行生物活性研究,本试验对重组大肠杆菌进行诱导表达,收集重组鸡α-干扰素包涵体后进行复性纯化及免疫印迹试验,并通过测定病毒EID₅₀,在接种H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的鸡胚中进行干扰素抗病毒活性试验,运用微变量细胞病变抑制法进行重组鸡α-干扰素抗病毒效价的测定。结果显示复性后重组鸡α-干扰素的免疫印迹试验成功获得了预期条带,在鸡胚中重组鸡α-干扰素具有显著的抗H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒等活性作用。在CEF/VSV细胞系上测定重组鸡α-干扰素的抗病毒效价为1.5×2¹⁰ U/mg左右,高浓度重组鸡α-干扰素具有一定的细胞毒性。结果表明重组鸡α-干扰素蛋白具有免疫原性和抗原性,在鸡胚内具有较好的抑制或杀灭H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的效果,呈广谱性,抗病毒效价较高,为下一步抗病毒制品的创制奠定基础。     

干扰素在控制禽病毒性传染病上的应用

<正>自1957年lsaacs和lindenmann发现干扰素以来,干扰素已经显示出极强的抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节活性和应用前景。因而,干扰素研究越来越受到人们的广泛关注。目前,动物干扰素主要停留在基础研究和临床研究试验阶段,且大多数集中于鸡、猪、鱼等少数动物,但近年来也取得不小的进步,目前已有商品化的鸡、猪、犬等重组干扰素产品面市。本品就近年来国内动物干扰素的应用和在家禽等方面的应用作以介绍。     

干扰素的研究进展

干扰素(interferon,IFN)是多功能细胞因子家族中的一员,是一类高活性多功能的糖蛋白.大量临床研究结果表明,干扰素除抗病毒活性外,还具有广泛调节功能,如调节和控制细胞复制、增生及机体免疫系统功能,在恶性肿瘤、免疫疾病、血管增生性疾病和纤维化疾病等病理状态中发挥作用.而且,随着分子生物学及DNA重组技术的迅速发展,已经应用基因工程技术为人类抗肿瘤、病毒生产出大量高效的干扰素.所以,干扰素的研究与应用问题日益受到人们的广泛关注.作者将干扰素的研究进展综述如下.     

重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞分裂抑制作用

观察重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞的作用。无菌采取牛外周血，分离培养淋巴细胞，取第一代细胞，分为试验组和对照组。试验组加入不同浓度的重组牛γ-干扰素，作用5d，观察细胞数量及细胞凋亡效应。结果为试验组淋巴细胞数目下降，细胞凋亡效应减弱。试验结果表明，重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞具有抑制分裂及抗凋亡的作用。     

干扰素作用机制及其在抗口蹄疫病毒中的应用研究进展

干扰素(interferon,IFN)是人和动物细胞受到适宜刺激产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白,是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抗多发性硬化、抑制细胞增长和免疫调节作用的细胞因子。自20世纪50年代末发现干扰素以来,相关研究取得了巨大进展。文章综述了干扰素的抗病毒机制及其在抗口蹄疫病毒中的应用进展。     

兔干扰素研究进展

干扰素因其抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫活性及免疫调节作用被广泛关注和研究.兔干扰素的研究与其他动物干扰素的研究相比较为落后.文章综述了兔干扰素的分类、原核表达、真核表达、抗病毒活性的研究进展,并结合兔干扰素的相关研究进展进行了展望.     

禽类干扰素及其基因工程研究进展

干扰素是由干扰素诱生剂诱导生物细胞所产生的一类高活性多功能的糖蛋白。干扰素自被发现以来,由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视,在其基因结构、作用机理以及体外重组表达等方面都取得了巨大突破。作者综述了干扰素的基因结构、基因工程及重组干扰素的应用研究进展。     

表达鸡α干扰素重组酿酒酵母菌的构建与鉴定

通过构建鸡α干扰素真核表达载体,以获得能够表达鸡α干扰素的酵母工程菌株。首先根据GenBank公布的鸡α干扰素基因序列设计上、下游引物,以略阳乌鸡基因组DNA为模板,PCR扩增鸡α干扰素基因片段。然后,利用基因重组技术将鸡α-干扰素基因插入真核表达载体,通过菌落PCR和DNA测序确定目标载体,构建成功后转化至酿酒酵母AH109,再通过营养缺陷培养、质粒提取和PCR鉴定带JMB440-ChIFN-α载体的重组酵母菌株。最终通过酵母培养、总蛋白收集、SDS-PAGE电泳和Western blot等,确定鸡α干扰素基因能够与酵母菌株重组,并表达α干扰素,蛋白条带大小约为23ku,与预期结果一致,表明成功构建了表达鸡干扰素基因的工程酵母菌株。     

重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白体外活性评价方法研究

为建立稳定、便捷的重组鸡α干扰素/白细胞介素-2融合蛋白(rChIFN-α-Linker-ChIL-2蛋白,重组融合蛋白)体外活性评价方法,本研究分别采用ChIFN-α和ChIL-2 ELISA方法检测重组融合蛋白与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性;采用细胞病变抑制法检测重组融合蛋白在DF1细胞上抑制水疱性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)增殖活性;采用MTS法分别测定重组融合蛋白促鸡外周血T淋巴细胞(PBLC)和脾淋巴细胞增殖活性。结果表明,重组融合蛋白可以与抗ChIFN-α单抗和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应;重组融合蛋白在DF1细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV活性高于抗IBDV活性,且均明显高于rChIFN-α蛋白对照;不同浓度的重组融合蛋白均具有明显的促鸡PBLC和脾淋巴细胞增殖活性,且其促增殖活性明显高于rChIFN-α蛋白对照。本研究成功建立了重组融合蛋白体外活性检测评价方法,为进一步探究重组融合蛋白在鸡体内协同作用奠定基础。     

兽用基因工程干扰素的研究与临床应用进展

利用基因工程重组技术使干扰素规模化生产变为现实,而干扰素在抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等方面具有自己独特的优势,本文就基因工程干扰素的研究、临床使用情况作一综述。     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。     

禽类干扰素的研究进展

干扰素在抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等方面的应用展现出了很多优势，尤其是基因工程重组技术的应用使干扰素在临床生产中的大规模使用成为可能。本文从干扰素的产生、分子结构、生物学功能等几个方面综述了近年来关于禽类干扰素的研究进展。     

抗鹅α干扰素单克隆抗体的制备及初步鉴定

以含有鹅α干扰素(IFN-α)基因的真核表达载体pcDNA3.1-GOWN-α免疫BALB/c鼠,采用杂交瘤技术制备抗鹅α干扰素单克隆抗体(McAb),并对其部分生物学特性进行初步研究.实验获得2株抗鹅IFN-α的单克隆抗体.经鉴定,Ig亚类均为IgM,轻链为κ链;腹水效价均达到10-4以上;Western blot证实2株McAb均能与重组IFN-α发生反应,出现特异性条带;其中一株单抗能与鹅脾细胞诱导产生的天然干扰素反应;杂交瘤细胞株连续传20代以上及冻存后复苏,细胞生长良好,效价稳定.抗鹅IFN-α单克隆抗体的制备,为研究和检测IFN-α提供了一种重要的手段,并为其在免疫机制研究、免疫功能检测、纯化IFN-α等领域提供了广泛的应用价值.     

DNA限制性内切酶

基因工程的核心是DNA的体内、外重组、Berg,P.于1972年率先将SV-40病毒与P22噬菌体DNA加以重组.1973年Cohen,S.N.重组了抗四环素与抗卡那霉素的质粒并转化大肠杆菌,使其获得双抗性,从而首先完成了基因工程的操作.此后研究十分活跃,取得的成果日渐加多,利用无性繁殖系生产人胰岛素、干扰素便是其中突出的例子.可以预计,基因工程将引起工农医某些     

表达重组猪α干扰素的大肠埃希工程菌分批发酵动力学模型的建立

为探究表达重组猪α干扰素的大肠埃希工程菌的分批发酵动力学基本规律,以表达猪α干扰素的基因工程重组大肠埃希菌BL21(DE3)为实验对象,观察并研究重组大肠埃希工程菌在30 L发酵罐分批发酵过程中菌体生长、重组猪α干扰素生成和基质消耗的变化规律,根据经典的Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程对其实验结果进行非线性回归分析。结果表明:菌体生长呈典型的S型曲线,蛋白生成和菌体生长无明显的相关性,属于非生长偶联型;重组猪ɑ干扰素的产生和大肠埃希工程菌的生长速率及菌体积累量相关,菌体生长、基质消耗和产物形成模型的拟合度R2分别为0.99030、0.91095和0.96683,能较好地描述发酵中的动力学特征;重组猪ɑ干扰素蛋白得率提高了40%,由此建立的模型将为后续的连续补料、高密度发酵和工业化放大生产奠定基础。     

猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl),与鲑鱼精DNA(ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%~30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性,在MDBK(牛肾细胞系)中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。     

重组鸡α-干扰素对鸡新城疫感染的治疗及疫苗免疫的影响

对试验鸡进行新城疫人工感染的干扰素治疗试验,试验SPF鸡分成5组,1～3组分别于攻毒前24h、攻毒的同时和攻毒后24h注射重组鸡α-干扰素,4、5组作为病毒对照和空白对照。同时,还进行了重组鸡α-干扰素对新城疫弱毒苗和灭活苗免疫效果的影响试验,结果显示,试验2、3组的平均死亡时间明显延长,免疫试验免疫后14d注射重组鸡α-干扰素可以降低新城疫抗体的滴度。     

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡-γ-干扰素（Chicken interferon-γ，ChIFN-γ）的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光（1FA）及间接ELISA检测，表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示，重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的复制。而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明，重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ，并具有高效抗病毒活性。     

吉林白鹅α干扰素基因的原核表达及抗血清的制备

采用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素（JL-GolFN—α）成熟肽编码序列,将IFN—α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX—IFN—α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）的感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白（GST—IFN—α）。SDS—PAGE、Western—blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN—α融合蛋白（rJL—GoIFN-α）的分子量大小约为43ku,表达量占菌体总蛋白的25％。重组吉林自鹅仅干扰素,经谷胱甘肽Sepbarose-4B亲和柱层析纯化后,经过透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0．25mg／mL。将复性蛋白免疫新西兰白兔3次,制备高滴度的鹅IFN—α抗血清。本实验表达和纯化了鹅的IFN—α,并制备了兔抗鹅的IFN—α抗血清,为下一阶段鹅α干扰素重组蛋白的应用奠定了基础。