马铃薯AP2/ERF转录因子的克隆及植物表达载体构建

AP2/ERF基因家族转录因子普遍存在于植物中,参与植物体内的各种生物学过程,包括植物的生长发育、生物和非生物胁迫响应等。前期转录组测序的结果发现马铃薯‘加湘1号’一个AP2/ERF家族基因(PGSC0003DMG400012154)在接种晚疫病菌(Phytophthora infestans)24 h后被显著激活。从接种P.infestans 24 h的‘加湘1号’的总RNA中通过RT-PCR获得了该基因CDS序列为885 bp,BLAST分析显示该基因编码一个295个氨基酸残基的蛋白,并且含有1个AP2/ERF结构域,是AP2/ERF转录因子家族中的ERF亚家族的一员。本研究将该基因与XcmⅠ酶切的表达载体pCXSN连接,转化大肠杆菌,通过测序挑选插入正确克隆酶切验证,并成功转化农杆菌。本研究结果为进一步研究该基因的功能提供了帮助。     

植物EST-SSR技术及其应用

EST是指从EST cDNA文库中随机挑取克隆进行单轮自动测序所获得的短的、常常是未加编译的cDNA序列.目前,大约有200种植物共超过1 500多万条的EST的序列,研究表明对EST进行大规模研究已成为功能基因组学研究的最佳途经之一.分析和比较EST序列就可以得到关于基因的表达、功能及进化信息,利用大量的EST序列已经成为发现新基因及了解植物新陈代谢一种简便有效的方法.通过介绍基于植物表达序列标签(EST)的微卫星(SSR)标记的研究现状,并对一些植物中利用EST-SSR标记在遗传图谱构建、遗传多样性、通用性等方面的应用进行了综合评述.同时也提出利用EST存在的一些不足及发展趋势.     

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序, 获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释, 比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。     

菊花AP2/ERF家族全基因组分析

作为植物的转录因子家族之一,AP2/ERF基因家族在植物的发育调控、激素响应以及调控植物应对各种胁迫的生命过程中发挥关键作用。本研究基于菊花脑(Chrysanthemum nankingense)基因组,筛选到菊花AP2/ERF基因家族,并对该家族的成员进行基因与蛋白结构、蛋白理化性质、保守基序、启动子顺式元件、组织和胁迫条件下的表达特征等进行了相关分析。此外,结合现有的公共数据库的60个菊花转录组测序数据,通过WGCNA分析对该基因家族成员进行了初步的功能分类。研究结果表明：菊花AP2/ERF基因家族共筛选229个成员,分别将其命名为CnAP2001～CnAP2229。系统进化分析发现菊花AP2/ERF家族成员属于4个亚家族(AP2, ERF, DREB, RAV)以及3个Soloist (未分类)序列。通过WGCNA的方法,将筛选的39 508个表达的基因划分为36个模块。分析发现有31个AP2/ERF家族成员在花发育相关的7个模块,20个成员在胁迫相关的3个模块。综上所述,AP2/ERF家族成员在菊花花发育过程以及非生物胁迫过程中发挥着重要功能,本研究为菊花分子育种提供了新的思路...     

黄萎病菌诱导海岛棉全长cDNA文库构建及EST分析

采用SMART技术构建了海岛棉黄萎病菌诱导下根全长cDNA文库,并进行了质量鉴定和EST序列分析。结果表明,文库的重组率为92.3%,库容量为1.1×106pfu·mL-1,平均插入片段大于1.5 kb。生物信息学分析表明该文库包含大量抗病调节基因和抗病防御基因。COG功能分类发现了多个参与信号转导、防御反应、细胞骨架以及次生代谢产物合成与分解等不同功能类别的基因成员。文库中出现的高丰度表达基因主要有病程相关蛋白(PR蛋白)、谷胱甘肽硫转移酶基因(GST)、亲环素蛋白、短链乙醇脱氢酶、抗坏血酸过氧化物酶及转录因子等。文库的构建为深入研究棉花抗黄萎病分子机制奠定基础。     

银杏AP2/ERF转录因子鉴定及其ERF家族在逆境胁迫下的表达分析

AP2/ERF转录因子广泛参与银杏的生物学过程,其ERF基因家族存在着通过调控次生代谢来应对环境压力的可能。为探究ERF基因家族在这一过程中的应答机制,本研究分别构建了紫外和干旱处理下银杏叶转录组数据库,利用在线生物信息学工具对银杏AP2/ERF转录因子的保守结构域、理化性质及基因家族同源性进行分析,同时利用转录组测序技术检测了ERF基因家族在这两种逆境胁迫下的表达情况,筛选其中5个与类黄酮等代谢相关的ERF基因进行荧光定量PCR验证分析。结果表明,在银杏中共鉴定到61个AP2/ERF转录因子,根据其保守结构域特点分为4类,即ERF亚家族28个、DREB亚家族23个、AP2和RAV亚家族分别为5个。不同成员之间的氨基酸数目、等电点(pI)等理化性质有较大差别。从与拟南芥、大豆的序列同源性分析结果来看,同一个亚家族的成员之间亲缘关系较近。GbERF亚家族和GbDREB亚家族同属于银杏ERF基因家族,成员数最多。转录组预测分析结果显示,大部分ERF基因家族成员在紫外和干旱胁迫诱导下的基因表达量会增加。经验证,5个基因表达量的变化情况总体与预测结果一致。本实验结果为后期开展银杏ERF基因家族的功能研究提供科学依据。     

橡胶树皮乳管组织茉莉酸诱导相关因子AP2/EREBP基因的克隆与表达分析

摘要：茉莉酸（jasmonic acid,JA）可诱导橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）乳管分化,是乳管分化的关键信号分子。目前,对JA诱导橡胶树乳管分化的分子机理仍然不清楚。我们在前期研究中通过筛选JA刺激乳管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库,获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST。本研究在此基础上,采用RACE法完整地克隆了这4个AP2/EREBP转录因子基因的开放阅读框,蛋白氨基酸序列分析表明其中3个属于ERF亚类,1个属于RAV亚类;表达分析发现,这4个基因在乳管分化时期的橡胶树树皮组织的表达受JA诱导,随JA处理时间的延长,其表达量先增强后减弱,推测它们可能在JA诱导橡胶树乳管分化过程中起着重要的调控作用。     

芝麻全长cDNA文库的构建及序列分析

本研究采用Gateway建库技术构建了中国芝麻主栽品种豫芝11号的植株生长发育过程中不同组织的全长cDNA文库(SiFcDNA)。该全长cDNA文库容为5.6×106,文库滴度为1.12×106 cfu/mL。部分克隆检测显示,文库cDNA片段长度集中于1.0~3.0 kb,重组率为96.88%,全长cDNA比例为88%。随机挑取1152个单克隆进行5'端EST测序,共获高质量有效EST序列1088条,拼接得到单一基因序列867条,其中46条单一基因在NCBI数据库中没有查到相应的同源序列,可能为芝麻生长发育过程特有的新基因;所获单一基因序列被划分为26个GO功能亚类。此外,从获得的Unigene序列中挖掘出了173个SSR,分布频率为4.78 kb/SSR;AG/CT类型SSR出现次数最多,占总SSR的19.08%。高质量全长SiFcDNA文库的构建为深入开展芝麻功能基因组学研究奠定基础。     

小麦大粒突变体的SSH文库构建及分析

为了获得控制小麦籽粒大小的相关基因,本研究以小麦大粒突变体8008和烟农15为材料,利用抑制消减杂交技术,构建抑制消减cDNA文库。在双向库中随机挑取20个阳性克隆进行测序,共获得24条EST序列。在GenBank数据库中进行Blast比对和功能分析,12条EST与已知功能基因高度同源,主要包括光合作用相关基因、物质代谢相关基因、RNA功能相关基因等;5条EST序列与未知功能的禾本科作物cDNA片段高度同源,7条EST未能找到同源性匹配。     

NCBI和cDNA文库中栽培花生EST-SSR分子标记的开发及其特点

本研究利用NCBI的GenBank数据库中公布的花生86 132条EST序列以及利用高油酸品种E12所创建的cDNA文库中的12 501条EST序列,对这些序列进行前期处理,总共获得非冗余且拼接较长的singleton 11 260条,contig 9 972条.通过MISA软件分析发现两个EST库中共包含有3 104个SSR位点,占到总共非冗余序列的11.08%.这些SSR位点被分成二核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复以及混合核苷酸重复等,其中三核苷酸重复占的比例最多,分别占到NCBI和cDNA文库的43.0%和56.8%,二核苷酸和五核苷酸重复占到所有重复位点的第二位和第三位,六核苷酸重复的比例最少.在所有重复基序中,AG/TC重复的数量最多,分别占到NCBI和cDNA文库的8.65%和13.42%.在三核苷酸重复中,CTT/GAA出现的频率最大,分别占到6.7%和13.42%.所有这些SSR基序的长度在4～51个之间.     

从狼毒大戟中克隆蓖麻烯合成酶基因

本研究采用RACE-PCR技术从狼毒大戟(Euphorbia fischeriana Steud.)根中克隆到一个蓖麻烯合成酶(casbene synthase)基因,命名为EfCS(GenBank登录号为:JN862821)。该基因长1969bp,编码602个氨基酸,具有典型的萜类合成酶的基因结构。对CS基因编码氨基酸序列进行生化特性分析发现其理论等电点为5.36,分子量为69.3648kD。通过疏水性分析,发现CS整体表现为亲水性。进行导肽分析结果发现其具有叶绿体导肽。二级结构预测表明,CS蛋白由α-螺旋、延伸链、β-转角和随意卷曲构成,它们分别占到64.95%、6.64%、3.16%和25.25%。另外,对CS蛋白质进行三级结构预测,发现蓖麻烯合成酶属Ⅰ类萜类合成酶。     

利用SSH技术鉴定香蕉体细胞胚发生相关基因

本研究以野生蕉胚性悬浮系为材料,将胚性细胞增殖培养基上的香焦胚性悬浮系作为对照,体胚诱导培养基上的培养材料为处理,利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建野生蕉胚性悬浮系激素诱导的胚胎发育差异表达cDNA文库,随机挑选阳性克隆并进行生物信息学分析...     

大豆花叶病毒侵染初期的抗病性表达序列标签分析

以抗花叶病毒病品系东农8143为材料,利用抑制消减杂交技术构建了一个大豆花叶病毒接种初期的cDNA文库,共获得2000个阳性克隆。随机挑取64个阳性克隆测序,与GenBank进行BLAST_x和BLAST_n同源比较,其中49个有比较明确的比对结果,占测序EST的76.6%。测序的ESTs片段中最短的为136 bp,最长的691 bp,平均长度为456 bp,有41条序列带有Poly(A)尾。功能已知基因的EST涉及大豆的细胞自身保护、信号传导、抑制病原菌生长、系统获得性抗性以及持家基因等许多方面,其中SAR（Systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类和数量最多。未知功能ESTs与GenBank的dbEST库中序列比较表明,其中许多与生物、非生物胁迫cDNA文库来源的ESTs同源。     

]斜纹夜蛾取食诱导棉花抑制性消减文库的初步构建及生物信息学分析

 为了筛选棉花抗逆基因,实验室构建了棉花被斜纹夜蛾幼虫取食诱导的正、反向抑制性消减文库。文库随机各挑取1000个克隆进行PCR鉴定,发现插入片段长度主要集中在200~1000 bp之间。经反向Northern杂交筛选,正向文库随机挑取250个克隆测序,得到了35条非重复序列ESTs,反向挑取150个克隆,得到24条ESTs。GenBank数据库BLAST序列相似性比对功能分析表明,斜纹夜蛾幼虫取食胁迫棉花的应答过程涉及信号传导、基因调控、抗胁迫、防御反应、能量合成代谢、细胞生长延伸等多个生物途径。诱导表达的基因对斜纹夜蛾取食胁迫功能表现为一定的直接或间接保护作用。     

Genetic Analysis of Cotton Fiber Traits by Molecular Markers

1.Development of EST-SSRs derived from G.barbadense.One hundred and nineteen ESTSSRs were developed based on 98 unique ESTs from a cDNA library constructed in our laboratory using developing fibers from G.     

亚洲棉石系亚1号耐旱相关基因SSH文库的构建及其分析

通过抑制消减杂交技术成功地构建了亚洲棉石系亚1号耐旱相关基因cDNA文库。通过蓝白斑筛选、菌落PCR及生物信息学等分子生物学手段分析和检验了库的质量,最终筛选出阳性克隆392个。通过EST测序得到265个单一序列,其中41个为重叠群,224个为单拷贝。生物信息学分析结果表明,该文库含有大量与耐旱相关的基因,并且涉及植物生理中多种代谢途径。