Appendage regeneration in adult vertebrates and implications for regenerative medicine

The regeneration of complex structures in adult salamanders depends on mechanisms that offer pointers for regenerative medicine. These include the plasticity of differentiated cells and the retention in regenerative cells of local cues such as positional identity. Limb regeneration proceeds by the local formation of a blastema, a growth zone of mesenchymal stem cells on the stump. The blastema can regenerate autonomously as a self-organizing system over variable linear dimensions. Here we consider the prospects for limb regeneration in mammals from this viewpoint.     

Neurons: secretory activity during limb regeneration and induction in the newt

Material staining with aldehyde fuchsin appeared in sensory ganglion cells supplying a regenerating limb or nerve-induced blastema and in regenerating nerve fibers within the blastema. With the electron microscope, large (1000 to 2500 angstroms), dense granules were observed in the perikarya and within end bulbs of peripheral nerves. Secretory materials may be elaborated and transported by neurons during limb regeneration and induction in the newt.     

Molecular basis for the nerve dependence of limb regeneration in an adult vertebrate

The limb blastemal cells of an adult salamander regenerate the structures distal to the level of amputation, and the surface protein Prod 1 is a critical determinant of their proximodistal identity. The anterior gradient protein family member nAG is a secreted ligand for Prod 1 and a growth factor for cultured newt blastemal cells. nAG is sequentially expressed after amputation in the regenerating nerve and the wound epidermis-the key tissues of the stem cell niche-and its expression in both locations is abrogated by denervation. The local expression of nAG after electroporation is sufficient to rescue a denervated blastema and regenerate the distal structures. Our analysis brings together the positional identity of the blastema and the classical nerve dependence of limb regeneration.     

石鲽鳍细胞系的建立及三丁基锡对其毒性作用的研究

为建立石鲽鳍细胞系并研究三丁基锡对其毒性作用,根据石鲽鳍组织的特点采用特定酶消化法启动原代培养,并成功传代。试验结果显示,在24℃,培养于含有碱性成纤维样生长因子及20%胎牛血清的DMEM/F12培养液(pH值7.2)中的鳍细胞,生长分裂状态佳,为成纤维样细胞。传代培养后继续保持旺盛的生长分裂速度,可稳定传代。第60代石鲽鳍细胞的群体倍增时间为46.7 h,特征性染色体数目为48条。目前鳍细胞已传至第68代,已成功建立石鲽鳍细胞系。不同浓度三丁基锡处理后结果显示,1～80 ng/mL三丁基锡均可对鳍细胞产生明显的毒性作用,三丁基锡对鳍细胞的48 h-IC50值为39.87 ng/mL。     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

不同培养条件下欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞的生长优势

为建立欧洲鳗鲡病毒性疾病分离、鉴定的细胞模型,以欧洲鳗鲡胸鳍细胞人工培养适应株(第21代)为试验材料,采用人工培养基体外传代培养的方法,探讨欧洲鳗鲡胸鳍传代细胞体外培养的最适条件。观察比较不同培养基(L-15、RPMI-1640、高糖型DMEM)、血清成分(BS和FBS)及其浓度(5%、10%、15%、20%)对欧洲鳗鲡胸鳍细胞生长状态的影响。结果表明:含有10%胎牛血清(FBS)的L-15培养基最适合欧洲鳗鲡胸鳍细胞的生长。     

Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration

Foreign environments may induce adult stem cells to switch lineages and populate multiple tissue types, but whether this mechanism is used for tissue repair remains uncertain. Urodele amphibians can regenerate fully functional, multitissue structures including the limb and tail. To determine whether lineage switching is an integral feature of this regeneration, we followed individual spinal cord cells live during tail regeneration in the axolotl. Spinal cord cells frequently migrate into surrounding tissue to form regenerating muscle and cartilage. Thus, in axolotls, cells switch lineage during a real example of regeneration.     

条石鲷早期发育阶段鳍的分化

条石鲷仔稚鱼在室外水泥池进行培育,培育水温24-28℃,盐度28-32,pH7.6-8.4,对条石鲷早期发育阶段鳍的发育、分化进行了观察.结果表明:初孵仔鱼奇鳍鳍褶起始于头部,绕过尾部,终止于肛门;3日龄仔鱼出现胸鳍;8日龄仔鱼脊椎末端下侧出现放射丝;12日龄仔鱼脊椎末端开始上翘,腹鳍基形成;15日龄仔鱼胸鳍出现软条,背鳍、臀鳍在支鳍骨上方的相应位置分化出软条,尾鳍由圆形转变为截形,腹鳍形成2枚软条;20日龄仔鱼背、臀、尾鳍软条出现分节,腹鳍形成4枚软条,透明,无色素,尾鳍呈长截形,鳍中部略有内凹;30日龄稚鱼各鳍鳍条数目已发育完全,尾鳍鳍条出现分支,胸鳍和尾鳍还未有色素分布,背、臀鳍的鳍棘部已全部出现色素,软条部分还未完全着色素,腹鳍已全部着色素;40日龄进入幼鱼期,外部形态和成鱼相似,各鳍鳍条发育完全.条石鲷仔稚鱼胸鳍长与全长呈直线回归关系,且胸鳍长随日龄的增加而增长,呈指数关系.条石鲷各鳍的发育时序依次为胸鳍、尾鳍、背鳍、臀鳍、腹鳍.     

新疆大叶紫花苜蓿两种再生体系的比较

分别以新疆大叶紫花苜蓿幼苗的叶片和切去胚根的子叶为外植体,比较了传统胚胎发生途径和器官发生途径的两种不同的再生过程对苜蓿再生周期和再生频率的影响,初步得出器官发生途径是一种可行的快速高效的再生途径。结果表明,从种子处理到再生幼苗的生成,利用成熟种子的胚诱导分化成苗可以大大缩短再生周期,提高再生频率,是明显优于胚胎发生途径的另一种再生方式。     

牙鲆胚后发育过程中Ⅰ型脱碘酶基因的原位表达谱

甲状腺激素T3在鱼类胚后发育与变态发育过程中发挥着重要作用,甲状腺激素T4通过Ⅰ型甲状腺氨酸脱碘酶(Dio1)生成T3,因此,调查Dio1基因在胚后发育包括变态发育过程中原位表达谱,有助于理解T3在胚后发育中的具体作用。利用RNA整体原位杂交技术,发现Dio1主要在牙鲆肠道、鳃、肝、肌肉、鳍、眼睛周围等器官和组织表达,鳃、肠道、奇鳍中的Dio1原位表达谱有一定的规律性,尤其在生骨肌细胞向鳍褶中迁移、臀鳍和背鳍(包括冠状幼鳍)的鳍条和支鳍骨的发生过程中,Dio1可能通过影响这些组织器官的T3水平而发挥重要作用。     

Study on the Phenotypic Mutation Generated from ~(60)Coγ-ray Irradiated Oxlias triangularis Purpurea Regeneration System

Mutations induced from tissue culture are easily to be separated,which might be propagated in the same medium,especially for the color-leaf ornamental grass,Oxalis triaggularis purpurea.Mutations of the ornamental traits in the tissue culture bottle could be investigated easily.The 35 d regeneration system group showed the lowest adventitious bud number and adventitious root number among 4 inoculation dates by 50 Gy dose of ~(60)Coγ radiation.More studies were carried out based on the 35d differentiation state of O.triangularis purpurea regeneration system.The 35 d regeneration system was then irradiated by 10,25 and 50 Gy doses of ~(60)Coγ rays.Numbers of adventitious buds and roots induced from the regeneration system were cut down with the increment of radiation doses.Seedling length was not distinctly reduced at the absorbed doses of 10 and 25 Gy,but reduced distinctly under 50 Gy of ~(60)Coγ irradiation.The optimal irradiation dose for 35 d O.triangularis regeneration system survival and mutation induction was approximately 25 Gy.The M_2 phenotypic mutation rate was 2.9%,especially,and the leaf number mutation accounted for 76%of the total mutation.The phenotypic mutations,especially in the 10 Gy group,on 0.1 m M Vc containing MS medium were recovered,which indicated that ROS plays a key role in the phenotypic mutation induced by ~(60)Coγ -rays.     

茶壶枣离体多倍体诱导关键技术研究

目的离体多倍体育种是枣树育种的重要方法,对其关键技术的研究有利于建立和完善枣树离体多倍体育种体系,加快枣树多倍体种质的创制。方法以茶壶枣无菌叶片为材料,将预培养不同天数（7 ~ 20 d）的叶片固定后制成石蜡切片,进行细胞学观察以确定适宜的预培养时间。在此基础上,将叶片不定芽再生技术与秋水仙素染色体加倍技术相结合,在叶片预培养8、9、10、11 d后,分别用70和90 mg/L的秋水仙素处理48和72 h,并对处理后得到的不定芽进行流式细胞术倍性检测。结果通过对叶片最佳预培养时间的细胞学研究可以得出,茶壶枣无菌叶片在预培养8 ~ 9 d时,分生细胞的分裂能力最强,且未出现分化现象,在此时期用秋水仙素对叶片进行处理,可大大提高诱导率,并且可以有效避免嵌合体和混倍体的出现。染色体加倍试验发现,在预培养8 d后,用70 mg/L的秋水仙素处理72 h,其诱导率最高,达4.11%,并成功获得8株多倍体植株。通过流式细胞术确定这8株多倍体均为纯合四倍体。结论本研究探索出了将茶壶枣叶片不定芽再生体系与秋水仙素染色体加倍技术相结合,人工诱导茶壶枣多倍体的技术方法。      

斑马鱼下颌再生中神经与肌肉的关系

本研究旨在揭示斑马鱼下颌再生中神经和肌肉的关系。通过HE染色技术、免疫荧光组织化学等实验技术分别观察斑马鱼下颌神经和肌肉的再生过程,考察神经和肌肉的关系。研究结果显示,截面附近的神经纤维在剪切后5 h降解,剪切后2 d时完全消失。剪切后3 d,整个芽基所在位置已出现新生的神经纤维。剪切5 d时,芽基上布满大量的神经纤维。肌纤维在剪切后12 h已发生断裂,剪切后5 d形成芽基细胞并分化成各种前体细胞如肌肉前体细胞,剪切后9 d出现新生的肌细胞,剪切后14 d新生的肌细胞与新生的神经纤维建立神经肌肉接头联系,30 d后成为成熟的肌肉组织。结果表明:如果斑马鱼1/3的下颌被人为切除,下颌肌肉可以实现功能性再生,同时神经极可能在肌肉再生中发挥作用。但是如果切除部分超过1/3,则下颌无法再生复原,其原因有待进一步研究。     

提高胡麻花药培养中愈伤组织诱导率的关键技术研究

通过对胡麻花药培养与再生体系建立的条件探索，比较不同基因型的花药培养能力的差异．比较不同预处理对花药愈伤组织的诱导率。旨在建立高效的胡麻花药培养再生体系，筛选最佳的基因型，同时可为育种选择提供理想的材料。可为其他作物生物技术育种工作提供可借鏊的经验。     

超甜玉米细胞和组织培养及其后代育种

利用高培养力基因型与甜玉米杂交，其Ｆ１代进行花药培养具有较高的培养力，花粉胚的诱导频率可达２６％．甜玉米基因型通过幼胚培养，建立起２个可长期继代培养，大量再生绿苗的体细胞克隆，并获得了自交结实后代，同工酶分析表明，同一克隆再生植株可产生基因突变．常规高培养力材料与甜玉米杂交后代进行二环系培养，可以筛选出高配合力的超甜玉米自交系。     

仿生鱿鱼肉鳍扑动推进机理数值研究

在仿生机器鱿鱼的设计制作中,通过肉鳍摆动辅助腕的收缩以及喷水推进的组合,使得鱿鱼可以以多种运动形式进行游泳。为研究鱿鱼肉鳍的扑动推进机理,采用计算流体力学(CFD)方法对生物鱿鱼外形进行等比例数值建模,计算分析鱿鱼肉鳍在不同扑动角度下的水动力特性。在此基础上,通过改变肉鳍占体比例、肉鳍形状等参数,研究不同参数对鱿鱼肉鳍扑动推进性能的影响。结果显示:鱿鱼肉鳍扑动过程中肉鳍上下表面出现明显涡流区与压力差,鱿鱼在该压力差的作用下完成升沉运动与水平运动;当鱿鱼肉鳍占体比例超过0.3时,升沉力与水平推进力均随肉鳍占体比例的增加呈明显上升趋势,而阻力变化趋于稳定,适当增加肉鳍的占体比例可获得更高的扑动推进效率;横菱形肉鳍具有较高的推进效率与较低的游动阻力,在仿生鱿鱼设计中是一种较为理想的选择。研究结果为仿生机器鱿鱼的设计制作提供了计算方法和理论参考。     

药用植物灵菊七愈伤组织诱导及其染色体数目稳定性研究

研究了不同植物激素对药用植物灵菊七愈伤组织诱导、继代培养、细胞染色体稳定性的影响。结果表明,灵菊七的愈伤组织诱导、继代培养分别以MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为培养基较适宜。培养在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA上的愈伤组织细胞中期分裂相染色体数目稳定,为20条,而培养在MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L NAA上的愈伤组织细胞中期分裂相染色体数目不稳定,其中86.7%的细胞含有20条染色体,13.3%的细胞含有10条染色体,表明激素ZT会导致愈伤组织细胞的染色体数目不稳定。在81个被观察的愈伤组织细胞中,超过85%的细胞染色体数目为20,表明灵菊七的体细胞染色体数应为2 n=20。     

苹果转化细胞的悬浮培养及植株再生

以试管苗叶片为外植体,将绿色荧光蛋白基因（GFP）转入苹果品种昌红中,研究发现抗生素筛选压对苹果转化效率的影响主要表现为对转化细胞再生植株的抑制作用。虽然降低筛选压（10或20 mg/L卡那霉素）可获得较高频率（分别为62.0%和57.8%）的转化愈伤组织,但其对转化细胞再生植株的抑制仍然明显。通过建立转化细胞悬浮培养系,在无筛选压下获得大量的由悬浮转化细胞增殖形成的愈伤组织,该愈伤组织再转到无筛选压的再生培养基上,6周以后15.8%的愈伤组织可再生转化植株。研究结果显示,可通过建立悬浮培养系的方式消除抗生素筛选压的抑制作用,快速大量获得苹果转化植株,为进一步开展苹果转化基因的整合机制与表达特性研究,推动苹果转基因育种的应用奠定基础。