应用荧光定量PCR方法研究RPL29基因在通城猪和长白猪不同时期胚胎骨骼肌中的表达

为了研究蛋白合成相关基因RPL29在骨骼肌发育中的作用,采用SYBRGreen染料建立该基因的实时荧光定量PCR（QPCR）分析方法,并分析该基因在猪胚胎骨骼肌中的表达变化。以不同浓度稀释样本为标准品,建立标准曲线方程：y=-3.303X＋43．077（决定系数R^2=0．999）。分析表明：该方法具有较大的检验范围（PCR扩增Q值13～35）,很好的扩增效率为100％,熔解曲线显示产物特异的单峰,其Tm值为86．5℃。本研究以H3F3A基因为内参,用所建立的实时定量PCR方法,分析RPL29在妊娠33、65和90d的通城猪和长白猪胚胎骨骼肌中的表达变化。研究发现：RPL29基因在通城猪和长白猪胚胎骨骼肌发育过程中分别呈现下调和上调表达模式;妊娠33d时,通城猪中的表达水平高于长白,而妊娠90d时在长白猪中高表达;妊娠65d时两品种间无显著差异。结果显示RPL29基因可能与猪骨骼肌的生长发育有关,并可能影响产肉性状。     

猪ADSL基因克隆及其在部分组织中的mRNA定量表达

试验以通城猪为研究对象,在对猪ADSL基因全长编码区cDNA片段进行克隆、序列测定、与GenBank中已收录的其他14种动物的ADSL全长编码区序列进行同源性分析,并构建系统发生树的基础上,采用实时(相对)定量PCR方法对刚出生和65日龄两个不同生长发育时期的通城猪心、肝、肾脏、背最长肌4种组织的ADSL基因表达谱进行分析。结果表明,所克隆的ADSL基因片段大小为1 548 bp(GenBank登录号:GU249574),其中包含一长为1 455 bp的完整阅读框,通过核酸序列分析发现,该基因编码484个氨基酸;与GenBank中已收录的猪ADSL基因序列同源性最高,达99.9%;与恒河猴和黑猩猩的序列同源性最低,分别为66.3%和41.3%;15种动物的20条ADSL全长CDS序列聚类分布为两个主支。刚出生时的通城猪ADSL基因在心、肝、肾脏组织的mRNA表达水平均高于65日龄通城猪的心、肝、肾脏组织中的mRNA表达;然而,其背最长肌的ADSL基因mRNA表达水平则低于65日龄的通城猪。本结果为猪ADSL基因的生物学功能研究和遗传进化研究提供了分子依据。     

THBS3基因在长白猪和通城猪不同组织和不同时期骨骼肌中的表达分析

本研究主要探究血小板反应蛋白3 (thrombospondin-3,THBS3)基因在不同组织及不同时期骨骼肌生长发育过程中的表达规律。利用实时荧光定量PCR方法对THBS3基因在长白猪和通城猪中的组织表达谱,以及在胚胎期(33、45、65、70和90 d)和出生后阶段(0、9、30、60、120和160 d)骨骼肌中的差异表达进行了比较分析。结果表明,THBS3基因广泛表达于长白猪和通城猪各个组织器官,除胃和肠中的表达存在差异外,其在两个猪种中的组织表达谱基本一致,在肺脏中表达量最高。THBS3基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段(P<0.05),但胚胎期骨骼肌中的表达模式在两个猪种间存在一定差异,THBS3基因表达峰值出现在长白猪胚胎期45 d,而其在通城猪中表达峰值出现在胚胎期65 d。结果提示,THBS3基因参与了猪骨骼肌生长发育过程及不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控。     

猪肌肉糖原磷酸化酶基因的多态性及其与胴体和肉质性状的相关分析

试验旨在寻找不同品种猪的差异表达基因,并对其遗传效应进行初步分析。应用抑制消减杂交技术获得了在梅山猪、长白猪和大白猪中差异表达的肌肉糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)基因及其全长cDNA序列,序列分析结果表明,猪PYGM基因编码842个氨基酸,与人、牛、狗、小鼠、大鼠和羊的氨基酸序列具有96%、97%、96%、96%、96%和97%的相似性,而且该基因在各组织中表达量均很高。通过序列比对发现,在3′非翻译区(3′UTR)125 bp处存在1个突变。利用PCR-RFLP方法,在大白猪、梅山猪、长白纯种猪和170头大白×梅山F2代资源家系中检测了该突变位点的多态性并进行性状关联分析,结果表明,该位点的多态性与瘦肉率、骨率、肥肉率、平均背膘厚、眼肌面积、胴体长显著相关,尤其是活体瘦肉率AA基因型(大白猪、长白猪优势基因)比BB基因型(梅山猪优势基因)高3%,肥肉率低5%,与外来猪种瘦肉率显著高于本地猪的性状表现是一致的。因此,猪PYGM基因125 bp位点可能是一个潜在的分子标记辅助常规育种位点。     

五指山猪与长白猪65 d胎儿组织MRFs家族基因的表达研究

 
以五指山猪和长白猪妊娠65 d胎儿腿部骨骼肌、背部骨骼肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠、胃、脑10种组织为材料,采用qPCR技术,检测和研究MRFs基因家族成员（包括MyoD1、Myf4、Myf5和Mfy6基因）在以上10种组织中的mRNA表达水平及差异。结果表明：（1）MRFs家族成员除肝、肾、肠组织以外,在五指山猪65 d猪胎儿组织中mRNA表达水平均高于长白猪相应组织中的表达水平（P<0.05）;（2）MRFs家族成员表达水平在腿肌和背肌中的表达普遍偏高,其他组织中表达较低（P<0.05）;（3）2个猪种在以上10种组织中MRFs家族mRNA表达水平的高低分布基本一致,其相对表达量顺序为：腿部骨骼肌＞背部骨骼肌＞肝＞肺＞胃＞脾＞脑＞肾＞肠＞心。     

TIMP3基因在长白猪和通城猪不同组织及不同时期骨骼肌中的表达分析

采用定量PCR(Quantification PCR, QPCR)方法,比较分析了基质金属蛋白酶3(TIMP3)基因在长白猪和通城猪间的组织表达谱,同时比较分析了其在这2个猪种胚胎期(33, 45, 55, 65, 70和90 d)和出生后(0, 9, 30, 60, 120和160 d)骨骼肌生长发育过程中的差异性表达。组织表达谱结果表明,TIMP3基因在不同猪种的各组织器官中广泛表达,除在腿肌和胰腺中有所差异外,TIMP3基因在两个猪种间的组织表达谱基本是一致的,在肺脏和子宫中表达最高,在背肌、脾脏和胃中表达较高,在肠、心脏、肾脏和肝脏中表达最低。与出生后阶段相比,TIMP3基因在2个猪种胚胎期均显著高表达(P＜0.05),但其表达变化趋势在2个猪种间存在差异;与在长白猪胚胎期相比,该基因在通城猪胚胎期中的高表达水平维持在一个更大的范围内。本试验结果提示,TIMP3基因可能参与不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控,影响到不同类型猪种的产肉性状。     

猪CTSD全长cDNA的克隆和表达分析

以人CTSD mRNA全长序列为基序,在db EST库中搜索同源性大于80%、重叠大于40个碱基的猪EST下载经Seqman软件装配后,利用RT-PCR扩增到猪CTSD基因部分cDNA序列,进一步通过RACE技术获得cDNA全长（GenBank登录号为DQ018727）,猪CTSD基因cDNA全长2032 bp包括93 bp 5′UTR区、706 bp 3′UTR区和1 233bp ORF,编码410个氨基酸残基。其编码区与人、鼠、牛、羊CTSD编码区同源性分别为87.9%、78.2%、86.6%和85.0%,其氨基酸序列与人、鼠、牛、羊氨基酸序列同源性分别为86.6%、80.1%、86.0%和84.7%。疏水性分析和信号肽预测发现猪CTSD氨基酸序列存在至少7个疏水性区域,信号肽位点为第1-20个氨基酸残基。在NCBI进行Blast P搜索结果显示猪CTSD氨基酸结构中含有Asn（Asparagine,天门冬酰胺）结构域,与天冬氨酸蛋白酶3D结构同源性高达99.7%,具有真核生物天冬氨酸蛋白酶的典型结构。以猪多组织RNA池为模板,以1026 bp部分cDNA序列作为杂交探针进行Northern杂交,得到一条2000 bp左右特异条带,从而验证了RACE产物为全长cDNA并揭示该基因只有一个转录本。为了研究猪CTSD基因在体内不同组织内表达的特点,采用半定量RT-PCR对CTSD基因在猪10个组织中的表达进行研究,结果表明在10个组织中均有表达,且表达量与-βactin内参接近。     

从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析

试验旨在研究从江香猪γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ（CJ-poIFN-γ）基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501 bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（50.60%）和无规则卷曲（33.14%）为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。     

猪肠道钠氢交换载体(NHE3)mRNA表达的肠段特异性和发育性变化

旨在探讨猪肠道钠氢交换载体（NHE3）mRNA表达的肠段特异性和发育模式,为NHE在养猪生产中的应用提供理论依据。选取遗传背景相同的1、7、26、30、60、90和150 d蓝塘和长白公猪各5头,测体质量后屠宰,取十二指肠、空肠、回肠和结肠组织样品;以18S rRNA为内标基因,用实时荧光定量PCR法检测NHE3 mRNA在60 d长白猪表达的肠段特异性及其在蓝塘和长白猪肠道表达的发育模式。结果显示：长白猪肠道NHE3 mRNA的表达丰度为结肠、十二指肠、空肠和回肠依次降低,且结肠显著高于空肠和回肠（P〈0.05）。不同猪种NHE3mRNA在十二指肠和空肠的表达模式相似;蓝塘和长白猪NHE3 mRNA的表达丰度分别在7和30 d（十二指肠）、7和26 d（空肠）达最高水平（P〈0.05）。不同猪种结肠NHE3 mRNA的表达模式不同,分别与其在十二指肠和空肠的发育呈现不同的模式;蓝塘猪结肠NHE3 mRNA的表达丰度在26、90和150 d时显著低于长白猪（P〈0.05）。以上结果说明,猪肠道NHE3 mRNA的表达受到发育阶段、品种和肠段的调控,且在十二指肠和空肠间具有品种稳定性。     

猪ROCK1基因克隆、序列分析及时空表达研究

为进一步获得猪肉质性状候选基因Rho相关激酶1（Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）的序列特征、生物学功能及时空表达规律等信息，本研究通过PCR、SMARTer RACE PCR的方法克隆了猪ROCK1基因，应用生物信息学方法分析该基因的蛋白质序列在不同物种中的进化关系，并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法检测其在不同组织和不同猪种背最长肌不同发育阶段的表达。结果显示，ROCK1基因有2个转录本，包含4 065 bp的开放阅读框（ORF），编码1 354个氨基酸；猪ROCK1基因ORF序列与人、小鼠和大鼠的ORF序列的同源性分别为95%、91%和91%，相应的氨基酸序列同源性分别为98%、96%和94%，该蛋白在不同物种间高度保守；ROCK1基因的组织分布较广泛，不同发育阶段在同一组织中的表达会发生变化；胚胎期ROCK1基因在梅山猪背最长肌中的表达极显著高于大白猪（P < 0.01），出生后ROCK1基因在2个猪种背最长肌中的表达无显著差异（P > 0.05）。本试验结果为研究ROCK1基因在猪骨骼肌发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。