两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系(NUCOTN33B、NUCOTN99B)以及常规对照品系(苏棉12)不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量.结果表明,两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势,花铃期(NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为4.43和2.93 μg·g-1)和吐絮期(3.87和2.86 μg·g-1)的含量分别降至苗期第6叶(7.64和8.38 μg·g-1)的58%、35%和51%、34%;相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶,前两者均为后两者的两倍以上.     

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。     

转Bt基因棉花对烟粉虱天敌昆虫龟纹瓢虫的影响

在实验室控制条件下,以转Bt基因棉花GK12、33B、SGK321上的烟粉虱为食料饲养龟纹瓢虫,研究转Bt基因棉花上的烟粉虱对龟纹瓢虫生长发育及捕食的影响,同时利用Y型嗅觉仪,观察龟纹瓢虫对来自不同类型棉花的棉叶及其烟粉虱的嗅觉反应和视觉反应。结果表明,转Bt基因棉花和对应的常规棉亲本上的烟粉虱对龟纹瓢虫的发育历期和存活率没有明显的影响。龟纹瓢虫对棉花叶片、烟粉虱若虫、蜜露、蜕等4种物质的视觉反应之间没有明显的差异。对4种嗅源物质的嗅觉选择性的大小依次为：烟粉虱若虫＞蜕＞棉花＞蜜露;在两类不同的棉花之间,转基因棉花和常规棉,龟纹瓢虫对GK12、33B、SGK321等三种转基因棉花上的烟粉虱若虫的嗅觉选择性明显较对应的常规棉亲本SM3、33、SY321上的烟粉虱若虫小;对烟粉虱若虫的蜕,两种转单价基因棉花GK12、33B较对应的常规棉亲本上的小,而转双价基因的棉花SGK321上与对应的常规棉之间没有明显的差异。烟粉虱密度大于200头.皿_-1时,龟纹瓢虫捕食转基因棉花上烟粉虱的数量大于对应的常规棉花亲本,但烟粉虱密度小于200头.皿_-1时,龟纹瓢虫捕食转基因棉花上烟粉虱的数量小于对应的常规棉花亲本。龟纹瓢虫对烟粉虱的捕食符合HollingⅡ型反应。龟纹瓢虫取食转基因棉花上的烟粉虱的理论极限值、瞬间攻击率均大于常规棉花。     

用人工合成多肽作为半抗原制备Bt Cry1Ac的单克隆抗体

为了制备Bt Cry1Ac特异性单克隆抗体(MAB),本试验从NCBI获得了Bt Cry1Ac蛋白的氨基酸序列,根据抗原性、亲水性和表位性分析选定Bt Cry1Ac特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白（KLH）免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞34株。通过ELISA和免疫印迹试验从中筛选出与Bt Cry1Ac天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株（6G9）。ELISA和免疫印迹试验结果显示,该克隆株所分泌的MAB能对合成肽和Bt Cry1Ac产生特异性反应,而与同源的Bt Cry1Aa、Bt Cry1Ab天然蛋白均无交叉反应。通过对转基因棉花的ELISA 检测结果表明,本试验所制备的Bt Cry1Ac单克隆抗体能够有效的区分常规棉和抗虫棉,并且能对其中的Bt Cry1Ac蛋白进行特异性的识别。     

用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac试剂盒快速测定转基因水稻Bt杀虫蛋白含量的研究

 用 Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两个转 cry1Ab的水稻品系克螟稻 1号 ( KMD1)、克螟稻 2号 ( KMD2 ) ,及未转化的对照品种秀水 11米粒中的 Bt杀虫蛋白含量。结果表明 ,该试剂盒标样制作的标准曲线相关系数为 0 .985～ 0 .998,在 0 .0 5或 0 .0 1水平上显著。同批次试剂盒的不同试验及不同批次试剂盒的测定值均差异不显著。最低检测剂量达 0 .5 ng/g,每次测试时间比 Western dot blotting方法缩短约 2 h。试验表明 ,该试剂盒是定量检测转基因水稻 Bt毒蛋白表达的一种理想产品     

转Bt基因抗虫棉田害虫防治技术研究

1998～2000年对转Bt基因抗虫棉田不同害虫防治技术进行了研究,分别对棉铃虫、棉蚜、棉叶螨、棉象甲等害虫进行了药剂防治试验,结果表明,20%毒高氯乳油对棉铃虫、2 5%蚜虱立克乳油和10%吡虫啉可湿性粉剂对棉蚜、20%扫螨净可湿性粉剂对棉叶螨、25%星科乳油对棉象甲均具有良好的防治效果。根据不同施药时期防治抗虫棉田棉铃虫试验结果,表明防治棉田棉铃虫应在幼虫孵化高峰期,即在产卵高峰向后推迟3～5天为宜。通过综合分析,提出了转Bt基因抗虫棉田害虫的综合防治措施。     

转Bt基因玉米残体Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态

采用ELISA定量法研究了(28±1)℃下转Bt基因玉米植株残体不同组织所含Cry1Ab蛋白在黄褐土和红壤中的残留动态,并对其进行方程拟合。结果表明,转Bt基因玉米植株残体不同组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留动态基本一致,均呈前期快速降低和后期稳定下降2个阶段,但同一组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留变化速率存在显著差异,黄褐土中下降明显快于红壤,1周内表现尤为显著;不同组织释放的Cry1Ab蛋白在同一土壤中其残留差异显著,且受培养时间等因素的影响,总体表现为根>叶>茎,与初始时Cry1Ab蛋白土壤可提取量表现基本一致;双指数模型比移动对数模型和指数模型更符合转Bt基因玉米残体中Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态。     

转Bt基因棉花对土壤微生物的影响

在大田和盆栽条件下，以转Bt基因抗虫棉晋棉26号和其具有相似遗传背景的普通棉花品种晋棉7号为材料，研究棉花不同生育期的土壤细菌、真菌、放线菌及其生理菌种的变化。结果表明，转Bt基因棉晋棉对土壤微生物种类和数量有一定的影响，在某些生育期显著高于或低于普通非转基因棉花，或者差异不显著。因此，转基因安全评价需要对土壤微生物进行评价。     

NaCl胁迫下转Bt棉花和非转Bt棉花的生理反应差异

为研究NaCl胁迫下转Bt基因棉花和非转Bt基因棉花的生理反应差异,采用盆栽条件下不同浓度NaCl溶液浇灌处理,测定叶片细胞含水量(RWC)、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸(Pro)含量和Bt毒素蛋白含量。结果表明,NaCl胁迫下转Bt基因棉花和非转Bt基因棉花叶片细胞含水量比无胁迫明显降低,丙二醛含量明显升高,游离脯氨酸含量大幅增加,这些生理变化在转Bt基因棉花和非转Bt基因棉花之间没有显著差异,说明转入Bt基因对棉花的生长发育不会造成显著影响;在0.4%NaCl胁迫下,转Bt基因棉花Bt毒素蛋白含量出现了显著下降,说明在NaCl胁迫下转Bt基因棉花的抗虫性下降。     

转基因抗虫玉米转育株Bt蛋白的表达特性分析

为了对转基因抗虫玉米转育株 Bt 蛋白的表达特性进行分析,用Cry1Ab/Cry1Ac 平板试剂盒定量检测了3种含 Bt 基因的玉米回交后代品系 BC₁F₁ ( HZ3152、HZ3342、HC0142 ) 在相同生长时期不同组织和不同生长时期相同组织中 Bt 蛋白的表达量。结果表明,在乳熟期 BC₁F₁ 不同组织中 Bt 蛋白表达含量的高低顺序为: 叶片 ＞胚乳＞花丝＞种子苞叶;在BC₁F₁不同的生长发育阶段 ( 苗期、抽丝期和乳熟期 ),叶片中 Bt 蛋白的含量随生育期的推移呈明显先上升后下降趋势, Bt 蛋白含量在抽丝期达到最大,之后又开始下降;苗期 ( HC0142、HZ3152、HZ3342） Bt 蛋白的含量 (4.16、3.75和3.72 μg·g^-1 ) 和乳熟期 (5.56、4.58和4.79 μg·g^-1 ) 的含量分别是抽丝期 (6.05、5.36和5.50 μg·g^-1) 的 68%、69%、67% 和91%、85%、87%。一般在玉米生长后期 Bt 蛋白的浓度有所下降,但幅度不大,对其抗性不会造成太大影响。该研究表明 Bt 蛋白在玉米回交后代中可以稳定表达,对 Bt 的相关研究为转基因育种等提供了参考依据。     

Yield, Leaf Senescence, and Cry 1 Ac Expression in Response to Removal of Early Fruiting Branches in Transgenic Bt Cotton

Two-year field experiments were conducted at Linqing, Yellow River valley of China, to study the plant response to the removal of early fruiting branches in transgenic Bt (Bacillus thuringiensis) cotton (Gossypium hirsutum L.) from 2003 to 2004. Plants were undamaged and treated by removing two basal fruiting branches (FB) at squaring to form the control and the removal treatment, respectively. The plant height, leaf area (LA), dry weight of fruiting forms (DWFF), the number of fruiting nodes (NFN), photosynthetic (Pn) rate, and levels of leaf chlorophyll (Chl), N, P, K, and Cry 1 Ac protein in mainstem leaves were measured at a 10-or 20-d interval after FB removal, and the sink/source ratio as indicated by NFN/LA and DWFF/LA was determined. FB removal significantly increased the plant height, LA, and plant biomass in both years. Lint yields were increased 7.5 and 5.2% by removal compared with their controls in 2003 and 2004, respectively. Significant increases in boll size (5.7 and 5.1%) were also observed in removal than in control for both years. Either NFN/LA or DWFF/LA was significantly reduced by removal before 40d after removal; however, both NFN/LA and DWFF/LA were significantly enhanced by FB removal at 80d after removal compared to the untreated control. There was no significant difference in fiber quality in the first two harvests between removal and control, but fiber strength and micronarie in the third harvest were significantly improved by FB removal. In terms of leaf Chi, Pn rate, levels of total N, P, and K in late season, leaf senescence was considerably delayed by FB removal. Levels of Cry 1 Ac protein in the fully expanded young leaves were considerably higher in FB-excised plants than in control, indicating FB removal enhanced Cry 1 Ac expression. It is suggested that the yield and quality improvement with FB removal may be attributed to the increased NFN/LA or DWFF/LA in late season and delayed leaf senescence, respectively. FB removal can be a potential practice incorporated into the intensive cultivation system for enhancing transgenic Bt cotton production.     

昼夜变温下高温与干旱胁迫对Bt棉毒蛋白含量的影响及其生理机制

【目的】明确Bt棉叶片Cry1Ac毒蛋白含量对昼夜变温下高温干旱胁迫响应及其生理机制,为生产中Bt棉抗虫性的安全稳定利用提供参考。【方法】2019—2020年在扬州大学农学院,以常规种泗抗1号（SK-1）和杂交种泗抗3号（SK-3）为材料,以温度和土壤水分含量为因子,温度分别设为34℃（白天,7:00—19:00）/28℃（夜间,19:00—7:00）(A1)、38℃/28℃（A2）;土壤水分含量分别为田间土壤最大持水量的50%(B1)和60%(B2),并以32℃/28℃、田间土壤最大持水量的75%为对照（CK）。各处理分别持续4、7、10 d(DAS)。【结果】不同处理导致叶片中Cry1Ac毒蛋白含量降低,且随着胁迫时间的延长,下降幅度增加。处理间相比,A1B2处理下降幅度最少,7 DAS后开始显著低于CK;A1B1处理下降幅度其次,4 DAS后显著低于CK;A2B1、A2B2处理在4 DAS显著下降。可溶性蛋白（SP）含量、硝酸还原酶（NR）、谷氨酸丙酮酸转氨酶（GPT）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）、谷氨酰胺合成酶（GS）、游离氨基酸（aa）和谷氨酸合成酶（GOGAT）等活性变...     

Dynamics of Bt cotton Cry1Ac protein content under an alternating high temperature regime and effects on nitrogen metabolism

This study was conducted to investigate the effects of alternating high temperature on Cry1Ac protein content on Bt cotton cultivars Sikang 1(SK-1,a conventional cultivar)and Sikang 3(SK-3,a hybrid cultivar).In 2011 and 2012,cotton plants were subjected to high temperature treatments ranging from 32 to 40℃ in climate chambers to investigate the effects of high temperature on boll shell insecticidal protein expression.The experiments showed that significant decline of the boll shell insecticidal protein was detected at temperatures higher than 38℃ after 24 h.Based on the results,the cotton plants were treated with the threshold temperature of 38℃ from 6:00 a.m.to 6:00 p.m.followed by a normal temperature of 27℃ during the remaining night hours(DH/NN)in 2012 and 2013.These treatments were conducted at peak boll growth stage for both cultivars in study periods of 0,4,7,and 10 d.Temperature treatment of 32℃ from 6:00 a.m.to 6:00 p.m.and 27℃ in the remaining hours was set as control.The results showed that,compared with the control,after the DH/NN stress treatment applied for 7 d,the boll shell Cry1Ac protein content level was significantly decreased by 19.1 and 17.5% for SK-1 and by 15.3 and 13.7% for SK-3 in 2012 and 2013,respectively.Further analysis of nitrogen metabolic physiology under DH/NN showed that the soluble protein content and the glutamic pyruvic transaminase(GPT)activities decreased slightly after 4 d,and then decreased sharply after 7 d.The free amino acid content and the protease content increased sharply after 7 d.The changes in SK-1 were greater than those in SK-3.These results suggest that under DH/NN stress,boll shell Cry1Ac protein content decline was delayed.Reduced protein synthesis and increased protein degradation in the boll shell decreased protein content,including Bt protein,which may reduce resistance to the cotton bollworm.     

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

 采用ELISA方法研究了Bt棉花叶片中Cry1Ac杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明，不同环境下Bt杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中，Bt杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快，经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态（含量50 ng·g-1左右）。高温低湿条件下，Bt杀虫蛋白降解较快，达到稳定水平的时间短。Bt杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速，30 d后降解了85%左右。随着冬季的到来, 杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后，杀虫蛋白的降解加快，至 4月下旬检测不到Bt杀虫蛋白。     

转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab棉靶标害虫不防治环境下检测技术和生存竞争能力研究

[目的]为国家转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉环境安全评价技术的建立提供参考。[方法]在靶标害虫不防治的环境下,以杂交抗虫棉赣棉杂1号(CK1)和非转基因棉赣棉11号(CK2)为对照,对转双价抗虫基因(Cry1Ac+Cry2Ab)棉进行生存竞争能力研究。[结果]转双价双Bt基因抗虫棉与2个对照相比未显示抗虫优势;在株高、覆盖度、果枝层数、单铃壳重方面无显著竞争优势;在单铃籽棉重、单铃皮棉重、衣分率方面表现显著或极显著负竞争优势;在单株成铃、脱落率、籽棉产量方面与CK1相比无显著竞争优势,与CK2相比表现极显著和显著竞争优势;在皮棉产量方面与CK1相比表现极显著负竞争优势,与CK2相比表现极显著竞争优势。[结论]转双价双Bt基因抗虫棉推广种植可行性为一般。该项检测技术和评价方法有较好的适用性。     

逆境对转Bt+CPTi基因棉抗虫性的影响

以新研96-48及其转Bt+CPTi基因后的SGK36为材料,研究了不同逆境胁迫下快速生长的叶片对棉铃虫生长发育的影响。结果表明,寡照环境有助于转基因棉抗虫性的表达,干旱环境对转基因棉抗虫性影响较小,浸水环境不利于转Bt基因棉抗虫性表达。影响转基因棉抗虫性表达的主要原因可能与逆境导致转基因棉某些生理及形态的改变引发棉铃虫采食量变化有关。     

转Bt基因抗虫棉卡那霉素田间鉴定技术研究

对转基因抗虫棉不同时期、不同叶片对卡那霉素不同浓度的反应及其与棉花抗虫性的关系进行了较系统的研究.结果表明,选取4 000 mg·L-1的卡那霉素液在棉花苗期、蕾期涂抹棉株倒二片平展叶最适宜,田间卡那霉素反应与田间棉铃虫发生实况结果吻合率高.说明棉花田间抗卡那霉素反应能够准确检测转基因抗虫棉,可以作为一种快速简便的田间检测转基因抗虫棉的方法.