棉花品种区域试验中的抗病鉴定技术

棉花抗病鉴定是棉花品种区域试验中的重要组成部分。棉花品种区域试验中的抗病鉴定对象为棉花枯萎病和黄萎病。抗病鉴定方法为人工病圃鉴定，要求病圃中的棉花适宜发病程度是感病对照品种的病情指数达到50％左右。以相对抗病指数为抗病鉴定指标，根据鉴定材料的相对病指将其抗性分为免疫(1)、高抗(HR)、抗病(R)、耐病(T)和感病(S)共5级。     

不同VIGS体系在棉花中沉默效率的研究

[目的]比较不同病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在棉花中的沉默效率.[方法]本研究以35S启动子驱动的抗卡那霉素基因nptⅡ为目标基因,利用RNA病毒载体TRV和DNA病毒载体CLCrV构建基因沉默载体,研究这2套VIGS体系在棉花中的基因沉默效率和沉默持续时间的差异.[结果]TRV体系比CLCrV体系沉默效率高,T...     

病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)在豌豆基因功能研究中的应用

病毒诱导的基因沉默技术（vIGs）是近年发展起来的一种通过抑制基因转录研究植物基因功能的快速方法,豌豆早褐病毒（PE—BV）的VIGS技术已经被成功的应用于豌豆发育调控基因功能的研究。该文在概述VIGS原理研究进展的基础上,对基于PEBV的VIGS技术流程进行总结,并提出改善其缺陷的方法和合理的数据分析处理方式,认为基因的沉默效率与基因在调控网络中的位置,上下游基因的影响及基因间的功能冗余有关。     

棉花黄萎病抗病机制的研究进展

半个多世纪以来，对棉花黄萎病抗病机制的研究取得了很大进展。棉花黄萎病抗病机制是很复杂的，既有棉株体固有的抗性，又存在病菌侵染诱发的抗性。棉株遭受黄萎病菌侵染后，以其内部形成一些胶状体、侵填体等物理障碍或产生一些植保素等生化障碍或两者同时发生的反应形式来表现抗性。     

棉花黄萎菌病毒VdCV1 OTU蛋白的表达及纯化

采用Gateway技术将棉花黄萎菌病毒Vd CV1的OTU蛋白基因克隆至原核表达载体p ET42-DEST中,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21中诱导表达,然后通过镍柱亲和层析和分子筛纯化得到纯化的目的蛋白,并进行Western Blot检测。结果表明,BL21表达的OTU蛋白以包涵体形式存在,大小为97 ku。Western Blot检测表明,His标签抗体能与97 ku左右的OUT-His融合蛋白特异性结合。     

棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析

【目的】克隆陆地棉MYB家族基因GhMYB6,并对其在棉花抗黄萎病反应中的功能进行初步探究,为挖掘棉花抗病相关基因及棉花抗病育种提供参考。【方法】基于棉花转录组测序数据,筛选并克隆了响应黄萎病菌侵染的基因GhMYB6,对其序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在黄萎病诱导下的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步验证棉花抗黄萎病中的生物学功能。【结果】克隆获得的GhMYB6基因开放阅读框(ORF)为258 bp,编码85个氨基酸残基,理论等电点(pI)为9.34,脂肪系数为73.41,平均疏水性为-0.793,相对分子质量为9.86 kD,不稳定指数为73.41,为亲水性、碱性的非跨膜蛋白,无信号肽,定位于细胞核,在第11~63氨基酸处含有1个SANT结构域。GhMYB6蛋白与雷蒙德氏棉GrMYB6聚在同一小分支上,说明二者的亲缘关系较近。GhMYB6基因在V991侵染后6和12 h时相对表达量较对照(未侵染处理,CK)极显著下调(P<0.01),72 h时显著上调(P<0.05,下同),24和48 h时与CK无显著差异(P>0.05)。与阴性对照植株TRV:00相比,GhMYB6基因沉默植株萎蔫程度和叶片黄化更严重,病情指数显著升高,茎秆的褐变程度更严重,且茎段在培养基上生长的真菌菌丝数量明显增多。【结论】GhMYB6基因响应黄萎病菌V991侵染,当抑制GhMYB6基因表达后,棉花对黄萎病菌的敏感性增强,抗性明显降低,推测GhMYB6是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。     

棉花多抗病性鉴定筛选技术及其在育种中的应用

 通过建立准确、可操作的多抗病性鉴定筛选技术,有效地鉴定评价了棉花品种的抗黄萎病性、抗枯萎病性。在育种实践中,利用该技术可定向改良提高棉花品种的抗病性,并选育出我国第一套棉花抗黄萎病多菌系、高抗枯萎病的抗源种质川737,川2802,以及系列抗黄萎病、抗枯萎病品种川棉243,川棉239和川棉65,显示了该多抗病性鉴定筛选技术的科学性和实用性。     

番茄斑萎病毒N基因的VIGS载体构建

目的研究番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV) 核衣壳蛋白基因(N)对辣椒抗病性的影响。方法以易感TSWV的辣椒湘研11为研究对象,采用同源序列克隆获得辣椒CaPDS基因和TSWV N基因;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)和病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术构建辣椒CaPDS基因沉默载体(pTRV2-CaPDS)和TSWV N基因沉默载体(pTRV2-N),农杆菌GV3101注射接种辣椒,通过qRT-PCR检测重组载体沉默效率。结果湘研11接种含pTRV2-CaPDS载体菌液3周后,新叶出现白化现象,说明辣椒上的pTRV2-CaPDS沉默载体构建成功。qRT-PCR结果表明：pTRV2-N载体可高效沉默N基因,其表达量仅为6.79%±2.56%,说明沉默N基因后,湘研11不易感染TSWV。结论本研究成功构建了pTRV2-N沉默载体,沉默TSWV的N基因后辣椒对入侵的TSWV产生一定的抗性。     

新疆陆地棉抗病转基因棉花的初步筛选

通过花粉管通道法将天麻抗真菌蛋白基因导入新疆陆地棉3个品种(系),经过标记基因阳性试验和病圃生物学检测,得到初步的筛选结果.     

桑树PDS基因VIGS转化体系的构建与鉴定

[目的]建立桑树的病毒诱导基因沉默(VIGS)转化体系,为桑树功能基因的分析研究提供技术支持.[方法]以丰驰桑为试验材料,克隆含BamH I和Xba I酶切位点的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因片段,经Xba I和BamH I双酶切后与烟草脆裂病毒(TRV)连接构建重组病毒载体pTRV2-PDS,转化农杆菌GV3101后通过压迫注射方式侵染桑树幼苗叶片.[结果]克隆获得的桑树PDS基因干扰片段346 bp,与改造后的TRV质粒连接可成功构建携带桑树PDS基因的重组病毒载体pTRV2-PDS.桑树叶片被侵染15 d后,接种重组病毒载体pTRV2-PDS桑树的第二轮真叶开始出现叶片白化现象,侵染20 d后,白化现象沿叶脉向四周逐渐扩散,叶片呈现明显的白化表型.实时荧光定量PCR检测结果显示,重组病毒载体pTRV2-PDS侵染的桑叶PDS基因相对表达量仅为阴性对照(pTRV2)的58%,二者差异极显著(P<0.01),表明桑树PDS基因表达被有效抑制.[结论]利用TRV构建的桑树VIGS体系能有效沉默PDS基因,使桑树叶片呈现明显的白化症状,即可用于后续的桑树功能基因鉴定.     

病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响

以棉花为研究对象,利用转录后基因沉默技术(VIGS)将棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)基因沉默,研究沉默后植物的氨基酸、多胺、一氧化氮(NO)等含氮化合物的代谢变化。结果表明:盐胁迫可以诱导棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)瞬时上调表达,GhASS1沉默严重影响氨基酸的合成,除天门冬氨酰(Ans)外,其他蛋白质组成型氨基酸质量分数显著降低,NO质量摩尔浓度和多胺(PAs)质量分数下降,棉花植株生长发育迟缓。GhASS1沉默对棉花精氨酸脱羧酶基因(GhADC)、棉花鸟氨酸脱羧酶基因(GhODC)表现出强烈的抑制作用,进而影响植物多胺的代谢和耐盐能力。高浓度盐环境下,沉默体系精氨酸(Arg)和NO质量摩尔浓度上升,GhARG1表达上调。GhASS1沉默对于植物是致命的,GhASS1是尿素循环和氨基酸代谢的关键环节,GhASS1沉默使GhARG1、GhADC和GhODC表达下调,严重影响整个氨基酸代谢,NO质量摩尔浓度,腐胺(Put)和精胺(Spm)质量分数显著降低,N代谢受阻,植株发育不良,生长迟滞,棉花中存在Arg-NO通路。     

外源基因导入对棉花同工酶的影响

外源基因蛋白酶抑制剂CPTI、Bt导入棉株后 ,这些转基因抗虫棉材料的过氧化物同工酶 (POD)酶带一致 ,酶谱差异不明显 ,有的只是酶谱色的深浅不同。酯酶同工酶 (EST)的酶谱随棉花种植的世代数 ,与亲本的差异越大。     

EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT-PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物(GFLV-H)基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段,并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector.序列分析结果表明,该基因含有1515个核苷酸,编码504个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88%和95%.目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121,经三亲交配导入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中.     

OsMAPK4基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出1500bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的OsMAPK4基因序列同源性达99.4%,氨基酸同源性达99.1%。进一步将OsMAPK4基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBCE12和pBC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12和pBM29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsMAPK4基因的功能奠定了基础。     

OsMAPK7基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以低温处理的耐盐水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板,用OsCDPK7基因特异引物通过RT-PCR扩增出1 700 bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该序列与GenBank上的OsCDPK7基因序列相比,缺失了CDS序列中157￣234处的78个核苷酸,其编码的蛋白序列缺失了53￣78的26个氨基酸。但是缺失部分位于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性中心和钙结合基序等结构域之外,因此预计该基因产物应具备钙依赖的蛋白激酶活性。进一步将OsCDPK7基因分别克隆至植物表达载体卡盒pBE12和pB29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的OsCDPK7基因植物表达载体pBC7E12和pBC729A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导法转化植物,分析OsCDPK7基因的功能奠定了基础。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因植物表达载体的构建

以含传染性支气管炎病毒（ZJ971毒株）S1基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.7kb左右的S1基因产物；用XbalI和BamHI酶切纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，定向克隆到植物表达载体PBI121中,PCR及酶切鉴定表明，质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中。     

Up-regulation of a homeodomain-leucine zipper gene HD-1 contributes to trichome initiation and development in cotton

Plant trichomes originate from epidermal cells. In this work, we demonstrated that a homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) gene, Gh_A06G1283 (GhHD-1A), was related to the leaf trichome trait in allotetraploid cotton and could be a candidate gene for the T₁ locus. The ortholog of GhHD-1A in the hairless accession Gossypium barbadense cv. Hai7124 was interrupted by a long terminal repeat (LTR) retrotransposon, while GhHD-1A worked well in the hairy accession Gossypium hirsutum acc. T586. Sequence and phylogenetic analysis showed that GhHD-1A belonged to the HD-Zip IV gene family, which mainly regulated epidermis hair development in plants. Silencing of GhHD-1A and its homoeologs GhHD-1D in allotetraploid T586 and Hai7124 could significantly reduce the density of leaf hairs and affect the expression levels of other genes related to leaf trichome formation. Further analysis found that GhHD-1A mainly regulated trichome initiation on the upper epidermal hairs of leaves in cotton, while the up-regulated expression of GhHD-1A in different organs/tissues also altered epidermal trichome development. This study not only helps to unravel the important roles of GhHD-1A in regulating trichome initiation in cotton, but also provides a reference for exploring the different forms of trichome development in plants.