家蝇溶菌酶1基因的克隆、序列分析及原核表达

采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）,对鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库（SSH）中筛选得到家蝇溶菌酶1基因（（Musca domestica lysozyme-1,MdL-1）进行扩增,测序分析得到一个全长为537bp的cDNA片段,其开放阅读框（ORF）432bp,与Genbank中登录号为AY344589．1基因同源性为96％。构建重组表达质粒pET-32a-MdL-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β—D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析显示。表达产物大小约为34kD,与预期蛋白大小一致。结果表明,利用RACE技术克隆得到MdL-1全长基因并在大肠杆菌中获得了表达,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。     

绵羊Klf4编码区的克隆、序列分析与原核表达

参照GenBank上牛和猪的Klf4 cDNA序列设计特异引物,采用RT-PCR方法从怀孕60d的胎绵羊皮肤总RNA中扩增绵羊Klf4基因编码区序列,利用生物学软件对其进行序列分析;将该编码区连接到原核表达载体pET-30b(+)上并转化BL21大肠杆菌,在IPTG诱导下进行表达。经测序,绵羊Klf4基因编码区序列包括终止密码子在内的1 434bp,编码477个氨基酸,已在GenBank上登录(登录号GQ280389),与牛、猪、马、人、猕猴、黑猩猩、鼠等物种相比,绵羊Klf4基因CDS区的核苷酸序列相应序列同源性分别为98.26%、93.81%、93.24%、90.24%、90.13%、90.37%和87.25%,其氨基酸序列同源性分别为99.58%、97.94%、96.02%、94.14%、93.51%、92.08%和92.66%;生物软件分析显示,绵羊Klf 4含有细胞核定位模体和锌指结构域。利用克隆获得的绵羊Klf4 cDNA所构建的表达载体pET-30-Klf4,经IPTG诱导在BL21大肠杆菌中成功表达相对分子质量约为57 000的融合蛋白His-Klf4。     

绵羊Gfrα1基因的部分cDNA克隆与抗原表位多肽的原核表达

旨在克隆绵羊Gfrα1基因序列,深入研究绵羊精原干细胞(SSCs)。本研究通过RT-PCR扩增和分子克隆的方法克隆到了绵羊Gfrα1基因的编码区大部分片段。结果,克隆得到的绵羊Gfrα1基因的大部分cDNA序列长1 312bp,包括1 311bp的开放阅读框(ORF),编码437个氨基酸,与牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠相应核苷酸序列的同源性分别为98.5%、91.3%、91.0%、88.9%和88.0%。根据获得的cDNA序列,预测已知片段的抗原表位区,并将抗原表位区序列插入pET-44a(+)载体,经转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,并通过亲和柱层析,纯化制备GFRα1抗原表位多肽。Western blot检测发现,经诱导表达的GFRα1抗原表位多肽约为18.2ku,与预测的大小一致。绵羊Gfrα1基因的克隆和表达研究,为进一步制作该基因的多克隆抗体奠定基础,为绵羊SSCs的分子水平鉴定及功能分析提供了研究条件。     

羊种布鲁氏菌dhbC基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌（E.coli） DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093 bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47 ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C₁₈₆₆H₂₉₆₈N₅₄₄O₅₆₂S₁₅,分子质量为42 496.3 u,理论等电点（pI）为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性（GRAVY）为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,其二级结构以α-螺旋（41.94%）和无规则卷曲（31.46%）为主。     

猪DECR1基因cDNA的克隆、序列分析及原核表达研究

旨在研究猪2,4-dienoyl-CoA reductase1(DECR1)基因的结构,揭示该基因的原核表达规律。试验以山西马身猪的肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术克隆了DECR1基因的cDNA全序列,并将其重组于pET32a+原核表达载体中,经酶切、序列鉴定正确后,重组质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达。结果表明:猪DECR1基因的cDNA全长2352bp,包括987bp的开放阅读框(ORF),53bp的5′非翻译区(UTR)和1312bp的3′-UTR;编码区(CDS)编码328个氨基酸残基与猪(电子预测序列)、牛、人、猩猩、猴、马、犬、鼠相应序列的同源性分别为99%、88%、88%、87%、87%、87%、87%和83%;SDS-PAGE电泳结果显示,在IPTG诱导4h时,外源蛋白表达效率最高;Western blot检测发现经诱导表达的蛋白产物大小约为35ku,与预测的大小一致。猪DECR1基因的克隆和表达研究,为进一步探究该基因的生物学功能及其分子遗传机制提供了理论基础。     

蒙古绵羊Ghrelin基因的克隆和原核表达

为了克隆蒙古绵羊Ghrelin基因,构建其原核表达载体,并检测其在大肠杆菌中的表达情况.本研究用RT-PCR方法从蒙古绵羊胃组织mRNA扩增获得Ghrelin基因的cDNA序列,克隆到pMD-19T载体后进行序列分析.将测序正确的cDNA序列与原核表达载体pET-32a(+)连接,并转化BL21( DE3)大肠杆菌.经...     

马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X₇-C-X₂₃-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。     

绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因ORF117的克隆及其原核表达

以甘肃景泰疑似羊痘(SP)患病绵羊的皮肤组织中提取的总DNA为模板,经PCR扩增获得SP病毒(SPV)ORF117基因.测序后分析表明,该基因由591个核苷酸组成,编码196个氨基酸;将该基因克隆于pET32 载体中,构建重组表达质粒pET-ORF117,用IPTG在不同条件下诱导表达,确定其最佳表达条件.SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白分子质量为42 ku,主要以包涵体的形式存在.在IPTG浓度为0.1 mM、温度为37℃、诱导6 h时表达量最大,约占菌体蛋白的30%.Western blot试验表明,融合蛋白可被羊痘阳性血清识别,这为研究其在新型疫苗和诊断的研究奠定了基础.     

乐至黑山羊肾溶菌酶基因克隆及原核表达

本研究对乐至黑山羊肾溶菌酶(LZLyK)基因进行了克隆、表达,并对其活性进行了测定。采用比较基因组技术,成功克隆了LZLyK基因,其cDNA长444 bp,编码147个氨基酸。同源性分析结果表明,氨基酸同源性与绵羊溶菌酶2(M32498.1)最高,达96.9%。构建原核表达质粒pET- LZLyK,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白LZLyK得到正确表达,分子质量约为16、30 ku。采用比浊法测定了LZLyK蛋白的活性,其活性为15 U/mL,表明LZLyK蛋白具有一定抗菌活性。运用实时荧光定量PCR发现在乐至黑山羊肝脏、肾脏、气管和皱胃中均有肾溶菌酶基因的表达,在胃中表达量较高。     

藏绵羊乳腺乳铁蛋白的克隆及序列分析

本研究以四川若尔盖县藏系绵羊为材料,利用RT-PCR方法扩增并克隆了藏绵羊乳铁蛋白(lactoferrin,LF)序列,运用生物信息学软件对其核苷酸序列和编码蛋白质的结构进行预测和分析。结果表明,克隆的LF基因全长2127 bp,共编码708个氨基酸,N端有19个氨基酸组成的信号肽,该蛋白质等电点为8.4,预测分子质量为77.2 ku;半定量RT-PCR分析结果表明,LF在乳腺、气管、淋巴、肝脏、泪腺和脾脏中都有表达,在肺脏中不表达。本试验克隆了藏绵羊LF cDNA全序列,并对LF和乳铁蛋白肽(lfcin,Lfc)核苷酸和蛋白质进行了分析,为进一步研究其生物学活性奠定基础。     

猪前胸腺素的分子克隆与原核表达初步研究

应用RT-PCR技术从猪肾脏中扩增到猪前胸腺素基因,测序结果表明,猪前胸腺素完整开放阅读框(ORF)共333 bp,编码109 aa,与已公布的2个猪前胸腺素基因核苷酸同源性均为99.4%.构建了重组质粒pET-32-mProTα,并转化大肠杆菌(E.coli)Rosetta 2(DE3).SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达产物约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为12.07 ku.MTT法试验证实,表达产物初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞的增殖.     

绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。     

羊口疮病毒陕西分离株B2L基因的克隆、序列分析及原核表达

为了对羊口疮病毒(ORFV)陕西分离株B2L基因进行克隆、序列分析及原核表达,根据GenBank已登录的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列,设计合成一对特异性引物,应用PCR技术扩增ORFV B2L基因,并将目的基因连接到原核表达载体pET-28a中,成功构建重组质粒PET28a-B2L,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,成功克隆了ORFV陕西分离株B2L全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株B2L基因与国内外已报道的ORFV毒株核苷酸同源性超过97.3%,氨基酸同源性超过95.0%。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为42ku的重组蛋白,该蛋白能与羊口疮阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为ORFV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研制ORFV单克隆抗体及抗体检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Mink Interleukin-4 Gene

In order to obtain high purity of interleukin 4 (IL-4) protein,the specific primers were designed and synthesized according to the mink IL-4 gene sequence in GenBank. The IL-4 gene was amplified by RT-PCR using total RNA of the lymphocyte isolated from the peripheral blood that induced by phytohemagglutinin (PHA). The length of IL-4 gene sequence was 399 bp which encoded 132 amino acids. Phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequences homology between mink and ferret was 99.2%,90.0% with Ailuropoda melanoleuca and Canis familiaris. Prokaryotic expression vector pProEX-HTb-IL-4 was constructed and induced by IPTG. The recombinant protein of 15 ku was isolated by SDS-PAGE and detected by Western blotting. Highly purified recombinant protein of mink IL-4 was obtained by His-Trap HP affinity columns method. This research laid the foundation for the further studies on the biological function of mink IL-4 gene.     

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

多杀性巴氏杆菌中recN基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在对多杀性巴氏杆菌recN基因进行克隆和原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中recN基因序列(登录号:CP003313.1)设计1对引物,通过PCR扩增获得目的基因片段,构建pET-28a(+)-recN重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 677 bp的recN基因序列,通过诱导表达的His-Tag融合蛋白大小约为66.94 ku,主要以包涵体形式存在。经生物信息学分析,recN蛋白的分子式为C₂₇₃₅H₄₄₂₈N₇₈₆O₈₅₅S₁₆,消光系数为24 785,不稳定系数为43.99,属于不稳定蛋白;理论等电点(pI)为5.62,为酸性蛋白;总平均亲水性为-0.316,与试验表达的包涵体蛋白性质相同,即同为疏水性蛋白;recN蛋白在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h,在酵母(体内)中的半衰期>20 h,在大肠杆菌(体内)中的半衰期>10 h;二级结构主要以α-螺旋(64.87%)及无规则卷曲(21.00%)为主;经疏水性分析,预测该蛋白有3个高疏水性区域和9个高亲水性区域。本试验结果为进一步探究多杀性巴氏杆菌recN基因的功能提供了参考依据。