犬瘟热病毒F蛋白融合信号肽单克隆抗体的制备及其表位的鉴定

为制备犬瘟热病毒(CDV)F蛋白融合信号肽(FSP)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达系统表达CDV HLJ1-13株重组FSP蛋白(rFSP)。将其免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌抗FSP蛋白MAb的杂交瘤细胞株G8D6E3E5,亚类鉴定结果显示该株MAb重链为Ig G2a型,轻链为κ型。构建一系列表达部分重叠的重组FSP片段,经western blot鉴定该株MAb识别的抗原区域为aa1～aa55,通过合成一系列重叠多肽,经ELISA进一步鉴定该株MAb识别的抗原表位为²¹QQHSTRSTET³⁰。采用western blot检测该株MAb与r FSP的反应原性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测该株MAb与天然FSP的反应原性。Western blot结果显示,CDV Snyder Hill和HLJ1-13株r FSP蛋白样品在34 ku左右均出现特异性条带;IFA结果显示,感染CDV Snyder Hill株48 h后的vero细胞出现红色荧光。以上结果表明,该株MAb既能够与原核表达的CDV...     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物，以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板，扩增出一约1000bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中，并将重组质粒转化E．coli BL21（DE3），用1．0mmol／L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示，F基因的表达量约占细菌总蛋白的35％。SDS-PAGE电泳显示，表达产物的分子质量约为55ku，与预计大小相符；经Western-blotting试验进一步证实，该基因获得了正确表达。     

水貂源犬瘟热病毒F基因真核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体PMD-18T-CDVF,用KpnI和BamHI双酶切克隆质粒PMD-18T-CDVF后,回收F基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pcDNA3.1真核表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-CDVF。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,证实成功地构建了重组质粒,从而为研究犬瘟热新型疫苗奠定了基础。     

貉源犬瘟热病毒的分离鉴定

采集大庆某貉养殖场病貉的病料,处理后接种于非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离。对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定,并用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染细胞中的病毒核酸。病料接种 Vero 细胞 72 h 后产生明显的细胞病变(CPE);病毒分离株可以被犬瘟热病毒阳性血清中和,中和效价为 1∶25;分离株对氯仿、乙醚敏感,对酸和热抵抗力弱,可以凝集鸡红细胞,其凝集作用可被犬瘟热病毒阳性血清所抑制; RT-PCR检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长287 bp,与预期设计的长度相同,经测序发现与MS01株的同源性为99%。结果表明,分离的病毒株为犬瘟热病毒,命名为CDV-DQ株。     

犬瘟热病毒F基因克隆及序列分析

从犬瘟热病毒检测阳性的3份(KM1、KM2、KM3)病料中进行F基因的克隆测序,并与其他5株代表性参考毒株的同一基因序列进行比较(国内外流行毒株以及疫苗毒株).结果表明,KM1与KM2有95.7%的核苷酸同源性,其氨基酸序列完全相同;KM3株与KM1有1个氨基酸的差异,与参考的5株犬瘟热病毒的F基因核苷酸和氨基酸分析同源性分别为91.1%～96.5%和96.8%～100%.     

水貂和狐犬瘟热病毒F基因的克隆与序列分析

为探寻免疫失败的原因,对山东某养殖场免疫后的发病水貂和狐犬瘟热组织病料分别提取RNA进行RT-PCR扩增。将PCR得到的部分F基因克隆到pMD18-T载体上测序,并与疫苗株ND进行序列分析。结果表明,水貂和狐的CDV与OND的核苷酸同源性为98.6%9、8.6%,氨基酸同源性为98.0%9、8.0%。水貂和狐两者核苷酸同源性为98.0%,氨基酸同源性为95.9%。     

犬瘟热病毒地方分离株F蛋白编码区5′端部分基因克隆与序列分析

犬瘟热(Canine Distempter)是一种急性、烈性、致死性、传染性极强的病毒病。在幼犬中本病的死亡率较任何其他传染病为高。近年来，随着人民生活水平的提高，家养宠物犬的数量越来越多，本病所带来的严重危害也越来越受到人们的重视。本病的病原体是犬瘟热病毒，该病毒基因组为单股负链RNA分子，由15690个核苷酸组成，共编码六种结构蛋白，其中融合蛋白(fusion protein，F)在CDV感染宿主细胞的过程中起重要作用。本研究应用基因克隆技术成功地克隆出采自本学院附属宠物医院一病例中犬瘟热病毒cUNA的F蛋白编码区5′端部分序列，并对其进行序列分析，为今后宠物犬的犬瘟热病快速诊断及分子病理学研究提供理论依据。     

1株貉源犬瘟热病毒的分离鉴定

为筛选貉源犬瘟热毒株,从取皮期乌苏里貉肺脏中收集巨噬细胞,通过ELISA试验筛选阳性样本,用Vero细胞分离培养,获得1株貉源犬瘟热病毒.提取RNA进行RT-PCR和F基因测序分析鉴定,结果证明,该毒株确为犬瘟热病毒,命名为CDV/R-20/12.为下一步的貉源犬瘟热疫苗的研究与制备奠定了基础.     

一株貉源犬瘟热病毒的分离与鉴定

从临床疑似犬瘟热的病貉组织中分离到1株病毒,经形态特征、血凝试验、中和试验、间接免疫荧光试验和分子生物学鉴定,该分离病毒为犬瘟热病毒。本研究为研究犬瘟热病毒貉株分子生物学特性、致病机理及构建基因工程疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒F1蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达和鉴定犬瘟热病毒(CDV)F1蛋白,本研究通过RT-PCR扩增了CDV HLJ2-07株F1基因,并将其克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得大小约为47.5ku以包涵体形式表达的F1重组蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白31.5%。Western blot分析表明,表达产物能够被兔抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。间接ELISA检测表明,重组蛋白与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒及犬波特氏杆菌等疾病的阳性血清无交叉反应。本研究为进一步建立检测CDV抗体间接ELISA方法及研制F1蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

犬瘟热病毒贵州株(CDV-GZ1)F基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株融合蛋白基因(F)序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的F基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株F基因的ORF全长1989 bp,氨基酸序列中具有5个潜在N-糖基化位点,氨基酸同源性与美国00-2601株和国内HL株较高,分别为91.6%和91.1%,表明该分离株与00-2601株和HL株具有较近的亲缘关系。     

犬瘟热病毒野毒株融合蛋白主要功能区基因的变异研究

根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白（Ｆ）基因的核苷酸序列，设计合成了１０条引物。用１对引物从延吉犬病料中扩增出了含Ｆ２区基因的３１４ｂｐ的片段。除两端引物序列外为２６５ｂｐ，编码８８个氨基酸。它与日本弱毒株（ＣＤＶ－Ｄ，Ｏｏｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株（ＣＤＶ－ＯＮ）、海豹瘟热病毒２型（ＰＤＶ２）、１型（ＰＤＶ１）在核苷酸和氨基酸水平上的同源性，分别为９８．１％和９５．５％、９６．２％和９３．２％和     

犬瘟热病毒A株N蛋白基因编码区的克隆与序列分析

本试验对犬瘟热病毒 ( CDV) A株 N蛋白基因编码区进行了克隆与序列分析。结果表明 :CDV A株 N蛋白基因编码区核苷酸序列与Onderstepoor株。 A75/ 1 7株及 2 544/ han95株的同源性分别为 97.5%、94%及 93 % ,编码氨基酸的同源性分别为 98%、97%和 96%。     

貉源犬瘟热病毒血凝素基因的克隆及序列分析

为了对1例貉源犬瘟热(CD)进行病毒检测并分析其血凝素H基因变异情况,本研究从1只疑似犬瘟热病死的貉采病料进行研磨,利用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒H基因,对扩增出的H基因片段进行克隆测序,并对得到的H基因序列进行分析。结果表明,该貉感染犬瘟热病毒,得到的H基因核苷酸和氨基酸序列与CDV野毒株同源性较高,分别为89.1%~98.0%和85.4%~97.5%。遗传进化分析表明其属于Asia-1型野毒株,N连接糖基化位点分析结果表明,该毒株在542aa处比参考野毒株多了1个潜在的N糖基化位点,在525aa-550aa间多出了1个抗原表位。     

应用套式PCR分段扩增犬瘟热病毒融合蛋白的全基因

为研究犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白各段功能,根据ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列,设计合成了１０条寡聚核苷酸引物。对此１０条引物进行不同的配对,将１株犬瘟热疫苗弱毒株细胞培养物的总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增,利用１次ＰＣＲ扩增得到了７个基因片段,最长的达１６６９ｂｐ,最短的为３１４ｂｐ;应用套式或半套式ＰＣＲ,扩增得到了能覆盖整个融合蛋白基因的８个片段     

犬瘟热病毒上海分离株M蛋白编码基因的克隆与序列分析

本研究以犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)上海分离株的总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV M蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,RT PCR扩增M蛋白基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV上海分离株M蛋白基因序列与CDV A75/17 株、Onderstepoort疫苗株等其它7株的同源性在95%以上;编码氨基酸的同源性也高于97%。推测M蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒贵州分离株N基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株N蛋白基因序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的N基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株N基因的ORF全长1572 bp,其编码氨基酸序列与国外Shuskiy株和01-2689株的同源性分别为98.9%和97.1%,与部分国内分离株同源性在95%以上,说明N蛋白是保守性较强的结构蛋白。