猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门(Shimen)株进行了比较分析。结果显示，GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为82．1％和82．6％，推导氨基酸序列的同源性分别为87．9％和88．7％；GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为83．6％和84．0％，推导氨基酸序列的同源性分别为89．3％和90．1％。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

猪瘟病毒E2基因的克隆与鉴定

根据猪瘟病毒Brescia株全基因序列设计合成特异性引物对P1/P2对，采用异硫氰酸胍一步法（略加修改），从PK15细胞培养物中提取石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株猪瘟病毒的总RNA。应用RT-PCR方法成功地扩增出E2全基因组约1273bp的cDNA片断，经电泳证明其大小与推测相符。分别将石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株的E2基因片段克隆到pGEM-T载体质粒，通过对这4个重组质粒的EcoRI酶切鉴定、直接与套式PCR扩增，并对E2主要抗原区域进行224bp的序列测定，表明E2全基因克隆成功，为E2全序列测定和结构与功能的分析奠定了基础。     

用金标卡与RT-PCR对猪瘟的快速诊断及其病毒E2基因的序列分析

试验用金标卡对临床检查疑似猪瘟的病猪抗体和抗原分别进行初步检测,同时根据GenBank已发表的猪瘟病毒E2基因的cDNA序列设计并合成1对特异性引物,提取病料总RNA,通过RT-PCR技术扩增长1 137 kb的E2基因片段并进行验证,再将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建了重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切和序列测定,说明均已成功获得了猪瘟病毒E2基因和重组体pMD18-T-E2.测序结果与国内外已发表的毒株分别进行序列同源性比较和数据分析及绘制系统进化树,结果表明:该毒株与国内标准毒株Shimen株和C株具有较高的同源性.表明用金标卡结合RT-PCR能对猪瘟进行快速诊断.     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插     

猪瘟病毒E2基因密码子偏爱性分析

本试验旨在阐明猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)囊膜结构(糖)蛋白E2基因的密码子使用规律,以期为选择高效的表达系统、探索基因功能提供理论依据.本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对CSFV E2基因进行密码子偏爱性分析.结果显示CSFV E2基因的CAI值为0.703,ENC值为53.161,表明E2在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第3位核苷酸尤其偏爱G或C;从与CSFV E2基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有25个、人有25个;CSFV E2基因共有34个稀有密码子,且还有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现.本试验结果表明酵母等真核生物与CSFV E2基因密码子偏爱性较为接近, 可作为其体外表达系统.     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

猪瘟病毒NS3蛋白ATPase/RNA解旋酶功能区的表达与纯化

采用RT-PCR 技术扩增出猪瘟病毒石门株和C株NS3基因的ATPase/RNA解旋酶功能区,将其克隆到表达载体pET-28a(+) 中,获得重组质粒pET-NS3SM和pET-NS3C;PCR、酶切鉴定和序列分析结果表明目的基因插入位置、方向和读码框完全正确;0.8 mmol/L IPTG诱导得到分子量为54kD 的目的蛋白,Western blotting结果表明,表达的目的蛋白与猪瘟高免血清没有出现肉眼可见的反应;通过ELISA试验结果表明,重组蛋白能被CSFV 阳性血清识别。     

表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究

应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。     

模猪场猪瘟野毒感染情况调查

利用ELISA方法对广西6个规模猪场送检的1626份猪血清进行猪瘟野毒感染情况调查。结果6个规模猪场均存在猪瘟野毒感染,其中母猪感染率为7.86%~29.21%,平均为17.52%,种公猪感染率为0%~23.52%,平均为11.83%,育肥猪感染率为5%~22.45%,平均为15.5%,断奶仔猪感染率为8.24%~18.57%,平均为12.69%。此检测结果与猪场临床发病情况基本一致,病猪多表现为繁殖障碍型、温和型的非典型猪瘟。     

猪瘟病毒增殖特性研究进展

从猪瘟病毒在体内外的增殖特性、病毒蛋白在RNA复制中的作用两个方面对猪瘟病毒的增殖规律进行了阐述,以期为猪瘟病毒致病机理的研究提供参考。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。     

咸阳地区猪瘟病毒 E2基因扩增与序列分析

为了解陕西咸阳地区猪瘟流行毒株 E2基因变异情况,采用套式 PCR 方法,扩增了17个流行毒株和2个市售疫苗毒株 E2基因主要抗原区,并进行了序列比对分析。结果表明,17个流行毒株和兔化弱毒株（HCLV）株相比,E2基因主要抗原区核苷酸同源性在79．0％～80．9％,氨基酸同源性在80．0％～84．4％。市售疫苗和 HCLV 株核苷酸同源性为93．4％,氨基酸同源性为90．0％。系统发育树分析发现17个流行毒株同属基因Ⅱ群。流行毒株与 HCLV 相应氨基酸位点相比,总体变异氨基酸位点占26．4％,呈现出典型的变异特征。17个流行毒株在2个氨基酸关键位点出现了705（T→I）、729（L→A）变异现象,可能导致抗原性发生改变。发现 E2蛋白高保守序列 RYLASLH（713～719）变异现象,即 XYSY01株719位发生了 H→R 变异。结果提示,近年陕西咸阳地区猪瘟病毒流行毒株变异较为一致,E2基因核苷酸与编码氨基酸有较明显的变异。