测定猪不同组织基因表达时RT-PCR内参基因的选择

以95kg体重育肥猪的不同组织为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,对SDHA、HMBS、TOP2B、ACTB、B2M、PPIA、GAPDH、HPRT1、RPL4、TBP和YWHAZ共11个候选内参基因表达量进行检测,应用geNorm程序对内参基因的稳定性进行分析。结果表明,肌肉组织中稳定表达的内参基因是TBP、RPL4,心脏组织中稳定表达的内参基因是GAPDH、RPL4,肝脏组织中稳定表达的内参基因是TBP、HPRT1,脾脏组织中稳定表达的内参基因是SDHA、ACTB,肺脏组织中稳定表达的内参基因是B2M、HPRT1,肾脏组织中稳定表达的内参基因是B2M、TBP。由此可见,不同组织中最稳定表达的内参基因不同,不同组织中标准化目的基因的内参基因也不一样。     

LPS诱导的免疫应激对肉鸡组织内参基因稳定性的影响

脂多糖(LPS)诱导的免疫应激下,选择适于校正肉鸡肝脏、心脏和回肠组织中目的基因表达量的内参基因。将30只1日龄的肉鸡随机分为对照组与处理组,21日龄时,处理组注射1 mg/kg的LPS,对照组注射等量灭菌生理盐水,2 h后,每组各取7只肉鸡的肝脏、心脏和回肠组织。通过实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)对各组织中β-肌动蛋白(ACTB)、β2-微球蛋白(B2M)、18 S核糖体RNA(18 S r RNA)、28 S核糖体RNA(28 S r RNA)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)共5个内参基因的表达定量,利用Ref Finder和Ge Norm软件分析内参基因的稳定性及配对差异。结果显示:LPS刺激下,5个内参基因的表达水平有不同程度的变化。18 S r RNA、ACTB和GAPDH适于肝脏中目的基因表达量的校正;B2M和GAPDH适于心脏中目的基因表达量的校正;18 S r RNA和ACTB适于回肠中目的基因表达量的校正。选择表达稳定性高的内参基因适于校正目的基因的表达量,RT-q PCR应根据不同的研究对象进行选择,建议选择2个或2个以上的内参基因。     

干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选在牛骨骼肌卫星细胞(MSCs)分化前后稳定表达以及不受MSTN基因表达影响的内参基因,试验以野生组(WT)、转染干扰MSTN组(si-MSTN)和对照组(NC-MSTN)的牛MSCs作为样品,选取HMBS、B2M、GAPDH、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1和YWHAZ作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对各候选内参基因的相对表达进行测定,首先利用3个独立评价软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分别对各候选内参基因在野生组牛MSCs增殖期(GM)和分化第3天(DM3)细胞中的表达稳定性进行评价,筛选出前5个表达相对稳定的候选内参基因;然后以此为基础,利用相同的方法分析MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天的细胞中上述5个内参基因的表达水平和稳定性。geNorm、NormFinder分析结果均显示,HMBS、B2M、TUBB、GAPDH和ACTB在牛MSCs分化前后表达较稳定,BestKeeper分析显示ACTB和TUBB相关系数(r)排序靠前,GAPDH、HMBS和B2M排序不是很高,但是GAPDH的SD值最小,因此选择这5个候选内参基因做后续试验;在牛MSCs MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天,geNorm、NormFinder软件分析结果显示,上述5个候选内参基因中GAPDH、TUBB和B2M表达最稳定,BestKeeper分析显示TUBB相关系数排名不是最高,但其SD值最小,综合以上分析,选择TUBB作为牛MSCs干扰组和对照组增殖期和分化第3天最适内参基因。研究结果可为以后进行牛MSCs在不同生长时期以及MSTN表达被调控后基因的表达分析提供参考。     

民猪外周血单核细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选

民猪是能够适应东北地区寒冷环境的地方猪种,但目前对其环境适应性相关基因的研究较少,也没有确定适合此研究所需的实时荧光定量PCR的内参基因。因此,本试验通过研究常用的12个内参基因（B2M、ACTB、RPL11、RPL4、YWHAZ、GAPDH、HPRT1、SDHA、HMBS、IDH3B、TUBB2B和TBP1）在不同环境温度下民猪外周血单核细胞中的表达稳定性,旨在确定合适的内参基因进行相关研究。分别在-25、5、10和30℃采集3头民猪耳静脉血分离出单核细胞,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper 3种软件分析12个候选内参基因的Ct值,筛选出表达稳定的基因作为内参基因。经geNorm和NormFinder计算获得各候选基因的M值发现,12个候选基因的表达均相对稳定,而BestKeeper的分析则显示ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1、TBP1、YWHAZ基因的SD值均<1,可用作本研究条件下的内参基因,而另外6个基因SD值则>1,不符合作为内参基因的标准。综合3种分析的结果,在本研究条件下,TBP1基因的稳定性最高,ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和YWHAZ基因也符合作为内参基因的标准,都可研究在不同环境温度下民猪外周血单核细胞中基因表达时作为内参基因。     

家兔不同发育阶段和组织中内参基因的稳定性分析

本研究旨在筛选出新西兰白兔不同时期不同器官中表达最稳定的内参基因。以胚胎期(E28.5)、幼龄期(10d)和成年期(A)3个阶段的新西兰白兔的肾、心和肝3种组织作为研究对象,按照RT-qPCR试验最低要求试验信息量(MIQE)的指导,运用RT-qPCR和在线内参基因稳定性评价工具RefFinder,比较6个常用的内参基因(GAPDH、HPRT1、18S rRNA、B2 M、Sdha、β-actin)mRNA的表达稳定性。结果表明,新西兰白兔的肝和肾组织中的6个内参基因在3个发育阶段最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH,而在心组织中最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、Sdha。在新西兰白兔胚胎期的3种组织中,最稳定的3个内参基因依次是GAPDH、β-actin、HPRT1,而在幼龄期和成年期最稳定的3个内参基因依次是HPRT1、GAPDH、β-actin。对新西兰白兔的3个发育阶段和3种组织的内参基因稳定性结果分析表明,最稳定的3个内参基因依次是β-actin、HPRT1、GAPDH。本研究证实,新西兰白兔不同的发育时期和组织中,最稳定的内参基因不同。推荐在进行新西兰白兔的相关试验时,可以选择上述表达最稳定的至少3个内参基因的几何平均数作为标准化相关RT-qPCR数据的指标,以确保试验组个体间的差异最小,和小变量的准确数据分析。     

猪骨骼肌内参基因的筛选及验证

内参基因的正确选择是获得目的基因准确表达的关键。本实验以不同时期（3 d、30 d、90 d和180 d）、不同性别（阉割公猪和母猪）关中黑猪的2种骨骼肌（背最长肌和比目鱼肌）为研究对象,用RT-qPCR技术及geNorm和NormFinder软件分析8个候选内参基因（GAPDH、ACTB、PPIA、TBP、B2M、YWHAZ、eEF-1γ和18SRNA）的表达稳定性。同时,以候选基因本身和两两混合作为内参基因,检测肌纤维类型标志基因肌球蛋白重链MyHC IIx的表达。结果表明：ACTB、B2M和TBP在背最长肌和比目鱼肌中的表达相对稳定;而MyHC IIx基因的相对表达水平的检测结果证实,在背最长肌和比目鱼肌中,将ACTB作为内参基因较好。     

基于实时荧光定量PCR筛选巨菌草内参基因

以巨菌草(Pennisetum giganteum)的叶片、茎、根为试验材料，通过分析8个基因18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB在正常生长、干旱以及盐碱胁迫下荧光定量PCR中稳定性表达情况，筛选巨菌草的稳定内参基因。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件计算内参基因的表达稳定值并进行排序，最终通过赋值法综合排序确定稳定内参基因。结果表明，内参基因的稳定性在不同处理下存在差异。其中，ACTB稳定性好，为本研究筛选出巨菌草的内参基因。本研究筛选出的内参基因，为后续巨菌草功能基因表达分析奠定了基础。     

湖羊小肠黏膜内参基因筛选

为选择湖羊小肠黏膜合适实时定量PCR的内参基因,本试验选用6只湖羊公羔,分别在42和84日龄各屠宰3只,研究候选内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶基因1(PGK1)、18S rRNA和β-肌动蛋白(ACTB)在十二指肠、空肠、回肠黏膜发育过程中表达是否稳定。结果表明:4个候选基因都获得特异性扩增片段;在不同的小肠肠段黏膜中,PG K1和A CTB表达最稳定,在不同日龄4个候选基因表达都较稳定;ΔCt法和ge Norm软件分析表明,ACTB表达最稳定。综上,利用实时定量PCR研究湖羊小肠黏膜的内参基因最佳选择为ACTB。     

鸡肌肉组织实时荧光定量PCR及Western杂交内参基因的筛选

本研究对5种常用"持家基因"作为鸡肌肉组织发育早期基因和蛋白检测内参基因的有效性进行了评价,为鸡肌肉发育相关分子检测中内参基因的选择提供科学依据。应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技术,分别检测了鸡12胚龄、17胚龄、1日龄和14日龄胸肌中β肌动蛋白(ACTB)、β微管蛋白(TUBB)、TATA结合蛋白(TBP)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和热休克蛋白70(HSP70)的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,在鸡发育早期胸肌组织中,仅HSP70mRNA和蛋白在各阶段间表达水平差异不显著,GAPDH、TUBB、TBP和ACTB的mRNA和蛋白表达水平在检测的各个时间点间均差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。HSP70更适合作为鸡肌肉发育早期基因和蛋白检测的内参基因。本结果为研究发育期鸡肌肉组织相关功能基因和蛋白提供了必要的方法学基础,对其他物种的相关研究也有重要借鉴意义。     

琥珀蚕内参基因的克隆及表达稳定性检测

琥珀蚕(Antheraea assama)是一种重要的野蚕种质资源。为了开展琥珀蚕功能基因的研究,选择合适的内参基因非常必要。通过c DNA末端快速扩增技术获得琥珀蚕功能基因研究的3个常用内参基因β-actin、GAPDH和18S rRNA的c DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析3个基因在蚕体不同组织中的转录水平,并利用标准化分析软件ge Norm和Norm Finder分析其表达的稳定性。结果显示,3个内参基因的表达稳定性依次为β-actin、GAPDH、18S rRNA。就组织表达而言,β-actin在幼虫的中肠、脂肪体、马氏管、气孔、丝腺和卵巢以及蛹的输卵管中表达相对稳定;就发育时期的表达而言,β-actin在蛾期的表达也相对稳定。此外,GAPDH在幼虫头部、表皮和血液中的表达相对稳定;18S rRNA在幼虫精巢中的表达相对稳定。对琥珀蚕功能基因表达进行qRT-PCR所需内参基因数量的分析表明,选用2个内参基因即可满足试验需求。     

Stability of expression of reference genes in porcine peripheral blood mononuclear and dendritic cells

Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) is a critical tool used to evaluate changes in gene expression. The precision of this tool is reliant upon the selection of reference genes whose expression remains unaltered in culture conditions and following stimulation. Stably expressed reference genes are used to normalize data so observed changes in expression are not due to artifacts but rather reflect physiological changes. In this study, we examined the expression stability of the porcine genes glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), succinate dehydrogenase complex subunit A (SDHA), eukaryotic elongation factor 1 gamma-like protein (eEF1), ribosomal protein L19 (RPL19), beta-actin (ACTB) and ATP synthase mitochondrial F0 complex (ATP5G1) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MoDCs), blood isolated dendritic cells (BDCs) and T cells with or without stimulation with lipolysaccharide (LPS). An M value was used as a measure of gene stability as determined using geNORM software. Recommendations for the use of reference genes include using GAPDH and B-actin in PBMCs: RPL19 and SDHA in T cells; RPL19 and B-actin in monocytes; RPL-19 and SDHA in BDCs: and RPL-19 and ATP5GA in MoDCs.     

Screening of the Reference Genes for the Study of Peripheral Blood Mononuclear Cells by Quantitative Real-time PCR in Min Pigs

Min pig is a local pig breed in Northeast China. It has been well-adapted to the local cold weather,but few genes related to its environmental adaptation have been studied. For studies about environmental adaptation of Min pig on molecular level,it is important to have proper reference genes for quantification of gene expression by quantitative Real-time PCR. In this study,12 reference genes (B2M,ACTB,RPL11,RPL4,YWHAZ,GAPDH,HPRT1,SDHA,HMBS,IDH3B,TUBB2B and TBP1) were evaluated for their potential as the reference gene in Min pig peripheral blood mononuclear cells under different temperatures. Blood samples were collected from 3 Min pigs which were under -25,5,10 and 30℃,respectively. Mononuclear cells were separated using density gradient centrifugation. Statistical algorithms including geNorm,Normfinder and BestKeeper were employed to assess the stabilities of these genes. Analysis of geNorm and Normfinder revealed that all these 12 genes were highly stable. However,ACTB,GAPDH,SDHA,HPRT1,TBP1 and YWHAZ genes (SD<1) were found to be more stable than other six genes (SD>1),of which TBP1 was the most stable one using BestKeeper program. To summarize,ACTB,GAPDH,SDHA,HPRT1, TBP1 and YWHAZ genes were suitable to be the reference genes,with TBP1 was the best one.     

梅花鹿茸鲜重与年龄的相关性研究及经济效益分析

以江苏地区的梅花鹿为对象,研究分析了梅花鹿鹿茸重量与其年龄之间的相关性。结果表明:9龄内梅花鹿的鹿茸重与年龄呈正相关(r=0.767,P<0.05),它们之间线性回归方程为y=0.345x+1.186。梅花鹿3～8锯的鲜茸单产很高,平均水平达3.28kg/锯。公鹿鲜茸重的变异系数在2～6龄之间逐渐减小,7龄之后又有上升的超势,其中以5～7龄的变异系数最小,分别为16.2%、6.1%、11.7%。相关数据分析表明,梅花鹿公鹿在1～4龄内经济效益较差,从5龄开始获利,年获利逐年增加,这种趋势与梅花鹿的茸产量变化趋势是一致的。     

Analysis of mitochondrial DNA protein-coding region in the Yeso Sika deer (Cervus nippon yesoensis)

In the present study, mitochondrial DNA sequences of the Yeso Sika deer (Cervus nippon yesoensis) were studied. Specifically, protein‐coding genes as mitochondrial NADH dehydrogenase subunits (ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 and ND6), cytochrome c oxidase subunits (CO I and CO III), ATP synthase subunits (ATPase8 and ATPase6) and cytochrome b. Also, phylogenetic analyses on eight mammalian species were performed, including the Muntjac deer (Muntiacus reevesi). The rate of amino‐acid substitution was lowest (3.74%) between Yeso Sika deer and Muntjac deer, and the values between Yeso Sika deer and other species (sheep, cattle, horse, pig, mouse, human and chimpanzee) were 6.63%, 7.30%, 12.55%, 13.03%, 23.59%, 24.82% and 25.04%, respectively. Among them, the highest value of divergence was recognized in ATPase8, and the second structure of ATPase8 showed a difference between the Yeso Sika deer and Muntjac deer as a result of the substitution of 34His→Tyr and 49Thr→Ile. In addition, we identified a substitution of an amino‐acid sequence (19Thr→Ala) between the Yeso Sika deer and Yakushima Sika deer (C. n. yakushimae). From these results, ATPase8 was also a variable region in Cervidae.     

Reference genes for canine skin when using quantitative real-time PCR

Quantitative real-time PCR (qPCR) facilitates the quantification of mRNA expression. Accurate qPCR analysis of gene expression requires the normalisation of data using a reference or housekeeping gene which is expressed at a similar level in all tissues tested. GAPDH is the most well known and most widely used reference gene but many papers have demonstrated that it is not stably expressed in different tissues. The aim of this study was to measure reference gene stability in canine skin using real-time qPCR. Skin samples from healthy control dogs (n=7) and dogs with atopic dermatitis (lesional skin n=7 and non-lesional skin n=7) were used to quantify seven reference genes (IMP, CG14980, S7, HIRA, GAPDH, RPL13A and SDHA) in canine whole skin. Three different statistical programs (Bestkeeper, GeNorm and Normfinder) were used to assess the stability of the reference genes. The results confirmed that GAPDH is not a stably expressed reference gene in canine skin; this finding may influence interpretation of previous qPCR studies on canine skin using this as a reference gene. RPL13A and CG14980 were found to be the most stably expressed genes in canine whole skin and would be more suitable as reference genes in future studies.     

东北梅花鹿产茸性能分析

通过对东北梅花鹿产茸性能的分析 ,证明长沙市养鹿试验场东北梅花鹿产茸量基本保持在一定的水平上 ;产茸量与鹿年龄的大小存在曲线回归关系 ;头杠茸的重量与再生茸的重量不相关 ;体重与茸产量存在着很强的相关性。这些指标可为华南地区发展养鹿业提供一定的参考依据。     

梅花鹿锯茸时出血特点及止血药物的研究

为达到更好的锯茸止血效果,对梅花鹿锯茸时出血特点及锯茸止血药物应用效果进行了观察:收取初角茸时呈渗出状出血;收取二杠茸时呈线状出血;收取三杈茸和畸型茸时呈喷射状出血,并且有节律地进行搏动。出血量随着鹿茸的产量和茸根围度的增加而增多,但是当收取茸根围度为(20.3±0.6)cm的畸型茸时却不存在这种明显的相关关系。同一茸型不同年龄的鹿,因茸重、茸根围度的不同出血亦有差别。根据鹿茸的组织结构、生长规律和梅花鹿生理特点,选用由中药组成的外用锯茸止血药方剂,通过锯茸止血试验,结果表明,该锯茸止血药无刺激性,止血快,抗感染能力强,创面愈合良好,对再生茸产量没有明显影响(P>0.05)。