实时荧光定量PCR研究蛋鸡组织基因表达的内参基因筛选

为筛选出蛋鸡不同组织中稳定表达的内参基因,试验以120日龄的海兰灰蛋鸡（Gallus domesticus）为试验动物,选取常见内参基因RPS2、β-actin、GAPDH和HMBS作为候选基因,利用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对4个候选内参基因的相对表达进行测定,利用独立评价软件geNorm和NormFinder对蛋鸡的4个候选内参基因在不同组织（心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肠、胫骨、胰脏和子宫）中的表达稳定性进行评价。结果显示,Ct值分析和geNorm程序分析均得出相似的结果,即RPS2基因始终占主导地位,稳定性最强,β-actin基因次之;NormFinder软件分析显示,HMBS基因稳定性最好,最佳组合为HMBS和RPS2基因;当分析不同组织中表达恒定的内参基因时,发现不同组织最稳定的内参基因也不完全相同。由此说明,不同的组织器官和不同的分析方法得出的结论虽然不完全一致,但它们却有着一定的潜在共性,发展趋势有一定相似性,即RPS2和β-actin基因相对稳定性更强。     

新生籽鹅组织qRT-PCR分析中内参基因的选择

分别以1日龄健康籽鹅肝脏、肾脏、心脏、肌肉和卵巢为研究对象,应用实时定量RT-PCR技术,探讨28SrRNA、18SrRNA、GAPDH、ACT、HPRT1、SDH和TUB等7个内参基因mRNA的表达水平。经过geNorm和NormFinder程序分析,结果显示7个内参基因稳定度由高到低依次为GAPDH=HRPT1〉28SrRNA〉TUB〉SDH〉ACT〉18SrRNA;基因表达的稳定值分别为0.215（GAPDH）,0.215（HRPT1）,0.339（28SrRNA）,0.471（TUB）,0.721（SDH）,0.888（ACT）,1.177（18SrRNA）;表明GAPDH和HRPT1这2个内参基因适合用于目的基因表达的校正。     

羊草不同组织实时定量PCR内参基因的筛选

为筛选羊草(Leymus chinensis)不同组织实时定量PCR(qRT-PCR)试验体系中的最佳内参基因,以羊草叶、茎、根、穗为研究材料,利用qRT-PCR技术分析TUA、TUB、18SrRNA、EF-1α、APRT、CYP、Actin和CBP20共8个常用候选管家基因的表达情况,并使用geNorm和NormFinder软件进行综合评价,以期筛选出羊草不同组织中最稳定的内参基因。结果表明,8个候选内参基因在羊草不同组织表达稳定性不同,其中,叶片中稳定性较高的内参基因是Actin;茎中稳定性较高的内参基因是EF-1a;根中稳定性较高的内参基因是APRT和18SrRNA;穗中稳定性较高的内参基因是TUB。本研究结果将为开展羊草功能基因的表达分析提供重要参考。     

乳腺癌细胞(MCF-7)内参基因的选择

将稳定转染了真核表达载体pcDNA V5 HisB-rib-esp的乳腺癌细胞(MCF-7)和正常传代细胞分别于10%和20%胎牛血清(FBS)的DMEM条件下培养,连续传代3次以上。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测上述4种细胞样品中5种常用看家基因3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)RNA聚合酶Ⅱ(RPⅡ)、β2微球蛋白(β2-M)、18S核糖体RNA(18SrRNA)的mRNA稳定表达情况,并使用geNorm程序对其稳定性进行评价确定需要的内参基因数目,以选择转染过程中表达最稳定的内参基因。结果表明,5种看家基因表达稳定度M值的排序为:RPⅡ=18SrRNA>β2-M>β-actin>GAPDH,需要2个内参基因(RPⅡ和18SrRNA)共同校正目的基因的表达。RPⅡ和β2-M分别是不同血清下和转染前后表达最稳定的内参。     

猪骨骼肌内参基因的筛选及验证

内参基因的正确选择是获得目的基因准确表达的关键。本实验以不同时期（3 d、30 d、90 d和180 d）、不同性别（阉割公猪和母猪）关中黑猪的2种骨骼肌（背最长肌和比目鱼肌）为研究对象,用RT-qPCR技术及geNorm和NormFinder软件分析8个候选内参基因（GAPDH、ACTB、PPIA、TBP、B2M、YWHAZ、eEF-1γ和18SRNA）的表达稳定性。同时,以候选基因本身和两两混合作为内参基因,检测肌纤维类型标志基因肌球蛋白重链MyHC IIx的表达。结果表明：ACTB、B2M和TBP在背最长肌和比目鱼肌中的表达相对稳定;而MyHC IIx基因的相对表达水平的检测结果证实,在背最长肌和比目鱼肌中,将ACTB作为内参基因较好。     

白羽王鸽不同组织RT-qPCR内参基因的筛选

内参基因的正确选择是获得精准、可靠RT-qPCR数据的重要前提。本研究随机选取3只28日龄的白羽王鸽,采集心、肝、脾、肺、肾、胸肌、腿肌、腹脂、卵巢9个组织作为实验材料,选取GAPDH、β-actin、18S rRNA和RPS24个常见的内参基因作为候选内参基因。利用RT-qPCR技术和geNorm、NormFinder、BestKeeper软件及Ct值分析法对候选基因在不同组织中的表达进行检测和稳定性分析。结果表明:geNorm、NormFinder软件分析与Ct值分析法的结果一致,即18S rRNA基因稳定性最佳,RPS2次之;BestKeeper软件的分析结果显示RPS2基因表达稳定性最好,18S rRNA基因次之。因此,推荐选择RPS2+18S rRNA的内参基因组合用于白羽王鸽不同组织基因表达的研究。     

桑果qRT-PCR候选内参基因的表达稳定性评估

桑果是药品和功能性食品研发的重要原料。近年来针对桑果发育和调控的研究多有报道,但所选用的内参基因并不统一。利用qRT-PCR方法,对9个候选内参基因在感染菌核病和处于不同发育阶段的桑果样品中的表达稳定性进行评估。通过geNorm、NormFinder和BestKeeper等3种统计软件的评估分析,发现在感染菌核病的桑果中GST1和Tub是表达最稳定的基因,而eIF-5α和60S是表达稳定性最差的基因;在不同发育阶段的桑果中,GST1和UBQ是表达最稳定的基因,而60S和eIF-5α的表达稳定性最差。综合分析认为,桑果发育和菌核病研究中应选择GST1作为qRT-PCR内参基因。     

小鼠卵巢组织定量PCR分析中内参基因的筛选

旨在选择小鼠卵巢组织中合适的内参基因,为研究卵巢发育过程中基因表达提供可靠数据。以不同年龄(0日龄、3周龄、5周龄、8周龄)小鼠卵巢组织为试验材料,Trizol法提取样本总RNA,并合成cDNA,根据已报道的小鼠(Mus musculus)各组织中相对稳定表达的8个常见内参基因(Gapdh、β-actin、β-tubulin、18S rRNA、16S rRNA、H2afz、Ubc、Rpl13a)的GenBank登录序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法构建卵巢cDNA等梯度(1∶10)稀释后的标准曲线;利用geNorm分析候选内参基因的表达稳定性(M);NormFinder筛选表达最稳定的内参基因;BestKeeper计算qRT-PCR结果的标准差(SD)和变异系数(CV),从而预测候选内参基因的稳定性。结果表明,8个内参基因的引物特异性较强,具有良好的线性关系;候选内参基因的表达稳定度排序:Gapdh=β-actin>18S rRNA>Ubc>16S rRNA> H2afz>Rpl13a>β-tubulin;其中Gapdh表达稳定性最好,且标准差及方差系数最小(SD:0.32,CV:1.95),H2afz标准差及方差系数最大(SD>1.0,CV:5.76)。综上表明,本研究成功获得出生后小鼠卵巢发育过程中稳定表达的内参基因(Gapdh和β-actin),可作为其基因表达研究中的最佳候选内参。     

脂多糖染毒小鼠稳定内参基因的筛选

本研究旨在筛选脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)染毒小鼠的理想内参基因。试验以健康小鼠肝脏和LPS染毒后3、6、12、18 h的小鼠肝脏为研究对象,荧光定量RT-PCR评价YWHAZ、HPRT1、PPIA、ACTB和18S rRNA 5个内参基因的表达情况,并用geNorm软件分析其表达的稳定性。结果表明,除18S rRNA在LPS染毒时不能稳定表达外,其余4个内参基因在健康小鼠肝脏和LPS染毒小鼠肝脏中均能稳定表达,其中PPIA和YWHAZ的表达最稳定。本试验结果为荧光定量RT-PCR研究LPS与小鼠相互作用时mRNA表达水平提供了依据。     

鸭茅根组织实时定量PCR分析中候选内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术已成为研究基因表达的重要技术之一。以鸭茅（Dactylis glomerata）根组织为材料,利用qRT-PCR技术检测ACTIN（肌动蛋白酶）、TCTP（翻译控制肿瘤蛋白酶）、UBC（泛素结合酶）、ZTL（ZTL蛋白酶）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸-脱氢酶）和SAMDC（腺苷甲硫氨酸脱羧酶）6个候选内参基因在不同非生物胁迫环境下的表达情况,并运用Genorm3.5,Delta-Ctmethod,NormFinder0.953,Bestkeeper1.0和RefFinder软件分析各候选内参基因在鸭茅根组织中的表达稳定性。结果表明：6个候选内参基因综合表达稳定性从高到低排序为ACTIN,TCTP,GAPDH,UBC,ZTL,SAMDC;在干旱胁迫、盐胁迫、涝胁迫、热胁迫与ABA处理条件下,表达稳定性最高的基因是ACTIN;在涝胁迫条件下,表达稳定性最高的基因是TCTP;在不同的胁迫条件下,表达稳定性最低的基因是SAMDC。综合分析可知,基因ACTIN和TCTP最适合作为鸭茅非生物胁迫研究的候选内参基因,这可为鸭茅非生物胁迫下各种基因表达研究奠定基础。     

Screening of Reference Genes for Gene Expression in Layer Hens Tissues Using Real-time Quantitative PCR

To screen the reference genes of stable expression in different tissues of Hy-line layer (Gallus domesticus), RPS2, β-actin, GAPDH and HMBS genes were chosen as candidate gene, the software of geNorm, NormFinder and the Ct value were employed to analyze their stability in eight tissues (heart, liver, lung, kidney, duodenum, tibia, pancreas and uterus) of 120 days of age layers using Real-time quantitative PCR technology. The results showed that RPS2 gene was always dominant stability by the analysis of Ct value and geNorm software, the β-actin gene was followed; The NormFinder software showed that the HMBS gene was relative stability, and HMBS and RPS2 genes were the optimal combination; When analyzed the expression of constant reference gene in different tissues, it found that the most stable reference gene in different tissues was not the same. Therefore, it concluded that different tissues had different optimal gene, but they had the common potential, RPS2 and β-actin genes had the relative expression stability comparing the other gene.     

H5N1禽流感病毒感染小鼠后内参基因的筛选

本研究旨在评定H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza virus,H5N1 AIV)感染小鼠后,脾脏组织中6个候选内参基因酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,Ywhaz)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1,Hprt1)、琥珀酸脱氢酶A亚基(succinate dehydrogenase flavoprotein subunit,Sdha)、β-肌动蛋白(β-actin,Actb)、肽基脯氨酰异构酶A(peptidyl prolyl isomerase A,Ppia)和18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)的稳定性。通过H5N1 AIV强毒株A/DK/GD/378/08感染小鼠,采用Real-time PCR方法分别于12、24、48、72、96、120和144 h检测感染组与对照组中6个候选内参基因的表达水平,然后用Genorm软件对内参的稳定性进行评价。结果表明,正常小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ywhaz/Hprt、Sdha、Actb、Ppia、18S rRNA;H5N1 AIV感染的小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ppia/Sdha、18S rRNA、Hprt、Ywhaz、Actb;综合评价正常和H5N1 AIV感染后小鼠脾脏组织中6个内参基因的表达稳定度由高到低分别为Sdha/Hprt1、Ywhaz、Ppia、Actb、18S rRNA。因此,小鼠脾脏组织中Ppia和Sdha是研究H5N1 AIV在机体中复制时最理想的2个内参基因;Sdha和Hprt1则是在研究H5N1 AIV与机体相互作用时最理想的2个内参基因。     

干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选在牛骨骼肌卫星细胞（MSCs）分化前后稳定表达以及不受MSTN基因表达影响的内参基因,试验以野生组（WT）、转染干扰MSTN组（si-MSTN）和对照组（NC-MSTN）的牛MSCs作为样品,选取HMBS、B2M、GAPDH、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1和YWHAZ作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对各候选内参基因的相对表达进行测定,首先利用3个独立评价软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分别对各候选内参基因在野生组牛MSCs增殖期（GM）和分化第3天（DM3）细胞中的表达稳定性进行评价,筛选出前5个表达相对稳定的候选内参基因;然后以此为基础,利用相同的方法分析MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天的细胞中上述5个内参基因的表达水平和稳定性。geNorm、NormFinder分析结果均显示,HMBS、B2M、TUBB、GAPDH和ACTB在牛MSCs分化前后表达较稳定,BestKeeper分析显示ACTB和TUBB相关系数（r）排序靠前,GAPDH、HMBS和B2M排序不是很高,但是GAPDH的SD值最小,因此选择这5个候选内参基因做后续试验;在牛MSCs MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天,geNorm、NormFinder软件分析结果显示,上述5个候选内参基因中GAPDH、TUBB和B2M表达最稳定,BestKeeper分析显示TUBB相关系数排名不是最高,但其SD值最小,综合以上分析,选择TUBB作为牛MSCs干扰组和对照组增殖期和分化第3天最适内参基因。研究结果可为以后进行牛MSCs在不同生长时期以及MSTN表达被调控后基因的表达分析提供参考。     

东北梅花鹿茸二杠与三杈茸中总磷脂和牛磺酸含量的比较分析

分别对 8对梅花鹿茸二杠茸与三杈茸中总磷酯和牛磺酸的含量进行了比较分析。结果表明 ,东北梅花鹿茸二杠茸与三杈茸之间的总磷脂和牛磺酸含量差异不显著 (P >0 .0 5 )。     

模拟增温下短花针茅实时荧光定量内参基因的筛选及验证

本研究以荒漠草原植物短花针茅(Stipa breviflora)为材料,在模拟增温处理下,通过q RT-PCR试验分析9个候选内参基因的表达稳定性,运用Delta-CT法,ge Norm,norm Finder,Bestkeeper软件及Ref Finder在线工具进行候选内参基因的稳定性分析。经普通PCR剔除3个内参基因后,6个候选内参基因表达稳定性由高到低排序为:TLF,18 s r RNA,APRT,TUBα,EF-1α,Actin2。以TLF作为内参基因,在模拟增温下短花针茅转录组数据库中随机选择5个基因进行验证。q RT-PCR结果表明,5个验证基因在增温与对照之间的相对表达量存在倍率变化,且与转录组测序中的变化趋势一致,从而确定TLF为短花针茅增温处理下的最佳内参基因。     

多孢木霉HZ-31菌株胁迫下野燕麦内参基因的选择

为构建多孢木霉（Trichoderma polysporum） HZ-31菌株胁迫下野燕麦（Avena fatua L.）基因表达的RT-qPCR技术体系,筛选稳定内参基因,本研究利用GeNorm,NormFinder,BestKeeper和RefFinder 4个程序,对接种多孢木霉HZ-31菌株的野燕麦样本中8种候选内参基因（18S,28S,TUA,UBC,ACT,GAPDH,TBP和EF-1α）进行基于SYBR Green的RT-qPCR分析。结果表明TBP,18S和UBC是木霉侵染时野燕麦中表达最稳定的内参基因,TBP和TUA,TBP和GAPDH,18S和TBP,UBC和18S为最适宜两内参基因组合,可作为多孢木霉HZ-31菌株与野燕麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。