共培养体系中滋养层细胞对牛核移植胚胎早期发育的影响

利用活体取卵(OPU)所得的卵母细胞与牛耳成纤维细胞构建牛体细胞核移植重构胚,并将所得的重构胚进行ACM(培养液)与不同滋养层细胞的共培养,分析不同滋养层细胞类型、传代次数、冻融处理对核移植胚胎体外发育的影响,探讨胚胎体外共培养中滋养层细胞的合适条件。结果表明:胎鼠成纤维细胞(MEF)培养组的囊胚率和胚胎细胞数(38.2%和135±2.1)显著高于牛颗粒细胞(GC)组(9.1%和101±4.6,P<0.05)和牛耳成纤维细胞(BAF)组(25.9%和115±3.1,P<0.05)。2～4代MEF细胞与胚胎共培养的效果(38.2%和135±2.1)明显好于原代MEF细胞(24.7%和108±3.1,P<0.05)或5～8代MEF细胞(22.8%和102±2.8,P<0.05),新鲜的MEF细胞比冻融处理后的MEF细胞培养效果好(38.2%vs.27.7%,135±2.1vs.110±1.7,P<0.05)。因此,用新鲜的2～4代MEF细胞作为共培养体系中的滋养层细胞有利于牛核移植胚胎的早期发育。     

猪体外受精胚胎、孤雌激活胚胎以及体细胞核移植胚胎的体外培养

【目的】本研究系统比较了体外受精胚（IVFEs）、孤雌激活胚（PAEs）以及体细胞核移植胚（NTEs）的发育率和囊胚质量，同时还比较了PZM-3和NCSU-23两种培养基培养对PAEs以及NTEs发育的影响。【方法】利用体细胞核移植技术、体外受精技术和孤雌激活技术分别生产猪的NTEs、IVFEs和PAEs，开展体外培养。【结果】（1）IVFEs、 PAEs 和NTEs的卵裂率分别为72.0％，66.0％和63.5％，各组间没有显著差异(P>0.05)；囊胚形成率分别为11.0％，22.6％和16.9％，也不存在明显不同(P>0.05)；然而，在囊胚质量，即ICM细胞数/总细胞数的比例上， IVFEs和NTEs均优于PAEs（0.448％，0.356％ vs 0.122％，P<0.05）。（2）对PAEs来讲，以PZM-3为基础培养基时囊胚率明显高于以NCSU-23为基础培养基时的处理组（35.4％ vs. 22.6％，P<0.05）；而对NTEs而言， 两种培养基在支持胚胎形成囊胚方面的效果相当（26.6％ vs. 21.1％，P>0.05），虽然PZM-3培养时胚胎卵裂率显著低于NCSU-23培养组（47.5％ vs. 63.5％，P<0.05）。【结论】（1）PAEs的囊胚质量在3种来源的胚胎中最差；（2）对PAEs理想的培养基，当用于NTEs培养时却不一定是最佳的选择。     

牛早期胚胎在不同培养液中体外发育比较

以卵丘/颗粒细胞单层作为共培养饲养层，比较了体外受精胚，卵母细胞孤雌激活胚和体细胞核移植胚在几种培养液中体外发育能力，以期筛选较适合体细胞克隆胚胎的体外培养系统。将体外受精卵分别置5种培养液中培养，囊胚发育率分别为20.43％、24.12％、32.10％、20.29％和29.03％，在CM1和CM2中囊胚的孵化率分别为8.64％和20％，结果表明，在添加10％的FBS时培养效果较好。卵母细胞孤雌激活胚在CM2-CM5中囊胚发育率分别是25.09％、29.84％和29.93％。核移植胚胎在CM3和CM5培养液中囊胚发育率为13.04％和9.26％。表明在共培养条件下CM3和CM5可以用于核移植胚胎的体外培养。     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

利用成年母兔耳部皮肤上皮细胞生产克隆胚胎的研究

本研究以成年母兔耳部皮肤上皮细胞为核供体，对兔体细胞核移植技术中融合、激活以及不同来源受体卵母细胞的选择等环节进行了研究，比较了不同电场强度对重构胚胎融合率、分裂率的影响。结果表明，细胞在培养10代后仍增殖旺盛，呈多角型，具典型的上皮细胞形态。     

牛胚胎体外培养体系的优化

将体外受精后的牛卵母细胞随机分组进行培养,比较了胎牛血清(FBS)和发情后7 d牛血清(E 7BS)、不同培养液(CR 1+3 m g/mL BSA、SOF+3 m g/mL BSA和SOF+0.1 m g/mL PVA)、共培养体系和不同培养液体积(0.1,0.5和2.0 mL)对胚胎发育的影响,优化了牛胚胎体外培养体系,并对该体系的稳定性进行了检验。结果表明,优化后的牛胚胎培养体系为:前48 h用CR 1+3 m g/mL BSA培养液,48 h后用CR 1+体积分数10%E 7BS培养液培养120 h,培养液体积为0.5 mL,并且采用共培养,受精后颗粒细胞保留48 h。用该培养体系培养的牛胚胎发育良好,平均囊胚率为44.9%,表明该优化培养体系较稳定。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

 以兔8-16细胞的新鲜胚胎或冷冻-解冻胚胎的卵裂球作为细胞核供体，成熟的去核卵母细胞作为细胞核受体。经显微操作，将分离的单个卵裂球移入去核卵母细胞透明带内，制成322枚组合卵。对组合卵施加一个1200伏/cm（V/cm）和80微秒（μs）的直流电脉冲，使卵裂球的细胞核导入去核卵母细胞之中。由新鲜供体胚胎或冷冻-解冻供体胚胎与去核卵母细胞构成的组合卵的融合率分别为87.2%(251/288)和73.5%(25/34)。将部分已融合的细胞核移植(Nuclear Transplantation，NT)卵置于含10%胎犊血清(FCS)的TCM199培养液中，在充以5%CO#-2+空气的培养箱内，于39℃下培养20小时，新鲜供体胚胎和冷冻-解冻供体胚胎的NT卵发育至2-4细胞的分裂率分别为58.0%(47/81)和53.8%(7/13)。将53枚NT卵移入同步发情的5只受体母兔的输卵管内，结果一只母兔于妊娠第33天经剖腹手术产出1只体重为70克雌性核移植仔兔。实验结果表明，兔8-16细胞阶段的新鲜胚胎和冷冻-解冻胚胎均可在细胞核移植中用作细胞核供体。     

哺乳动物体细胞核移植后核重编程的研究进展

介绍了核移植后核重编程的机制,并讨论了核移植重编程中DNA甲基化和组蛋白乙酰化对核移植胚胎的影响。     

不同类型绵羊胚胎体外发育率的比较研究

分别利用孤雌激活技术、体外受精技术及体细胞核移植技术生产不同类型的体外胚胎,比较不同类型胚胎的体外发育率和囊胚细胞总数间的差异,研究季节、卵巢保存条件和培养液对孤雌激活胚(PAE)和体细胞核移植胚(SCNTE)发育能力的影响.结果表明:PAE、SCNTE和体外受精胚(IVFE)的卵裂率没有显著差异;PAE的囊胚率(23.4%)显著高于SCNTE(18.2%);SCNTE的囊胚细胞数(120)显著多于PAE的囊胚细胞数(96),而与IVFE的囊胚细胞数(107)没有显著差异.繁殖季节卵巢PAE和SCNTE的发育率显著高于非繁殖季节.卵巢在14～18 ℃保存15～17 h,没有影响PAE的体外发育,却显著降低了SCNTE的卵裂率,且没有得到囊胚.SOFaa和CR1aa培养基对PAE和SCNTE的早期发育没有显著影响.由此可见,季节和卵巢的保存方式对绵羊胚胎的体外发育率有显著影响,且不同类型胚胎的质量也存在显著差异.     

延边黄牛体细胞核移植胚胎编码抗氧化酶的基因表达研究

为研究延边黄牛体细胞核移植(SCNT)胚胎编码过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的mRNA表达情况,以孤雌激活(PA)胚胎为对照,利用反转录PCR扩增延边黄牛SCNT胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA,琼脂糖凝胶电泳后使用计算机软件进行半定量分析。结果显示:延边黄牛SCNT胚胎编码CAT的基因在2细胞期开始表达,且与PA胚胎存在显著差异(P0.05);编码Mn-SOD的基因在8细胞期开始表达,与PA胚胎在16细胞期以上时期差异显著(P0.05);编码GPx的基因在4细胞期开始表达,与PA胚胎在4细胞期差异显著(P0.05),8细胞期以上时期差异不显著(P0.05)。与孤雌激活胚胎的差异表明SCNT胚胎抗氧化酶表达的异常可能是由核移植操作过程所引起的。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异。[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比。[结果]该序列与牛核糖体蛋白L31（ribosomal protein L31,RPL31）基因序列具有99%的同源性。采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍。[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据。     

牛体外发育胚胎特定阶段差异表达基因的研究

[目的]研究不同发育时期牛体外受精胚胎在基因表达模式上的差异.[方法]利用单个胚胎mRNA差异显示技术,对单个8细胞期胚胎与囊胚进行mRNA差异显示,获得1条特异表达条带,对其进行克隆、测序,并与GenBank进行对比.[结果]该序列与牛核糖体蛋白131基因(ribosomal protein 131,RPL3])具有99%的同源性.采用实时定量PCR技术检测8细胞期和囊胚期胚胎RPL31的mRNA表达量,结果表明,RPL31在8细胞期胚胎的相对表达量为囊胚期胚胎的3.2倍.[结论]为揭示和阐明控制牛早期胚胎发育的相关机理提供依据. Abstract： The cattle different stage embryos obtained from in vitro was studied using the technology of single preimplantation embryo mRNA different display:single 8-cell and blastocyst stage embryos were studied using technology of mRNA different display and one different fragment was found.The result suggested that this fragment displayed high homology (99%) to cattle mRNA for ribosomal protein L31.Then to detect the expression of RPL31 mRNA in 8 cell and blastocyst stage embryos by real-time quantitative PCR,the result showed the relative amount of 8 cells was 3.2 times of blastocyst's.     

牛ANGPTL3基因的电子克隆与序列分析

运用生物信息学方法,对牛ANGPTL3基因的cDNA进行了序列分析,并对推导的牛AN-GPTL3蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛ANGPTL3基因的cDNA由1 566个核苷酸构成,包括1 380 bp的开放阅读框,80 bp的完整的5′非翻译区和106 bp 3′完整的非翻译区,编码460个氨基酸。该基因cDNA编码区序列与野猪、狗、黑猩猩、人以及恒河猴编码区序列的相似性分别为90%,88%,87%,87%和86%,而推导出的氨基酸序列与野猪、狗、黑猩猩、人以及恒河猴的相似性分别为86%,86%,83%,83%和80%。利用该基因编码序列翻译的氨基酸序列与野猪、狗、黑猩猩、恒河猴和人同源基因相应序列构建分子进化树,结果表明,牛的ANGPTL3基因在上述5个物种中,与野猪的分子进化关系最近。     

牛脂联素cDNA全基因序列的克隆

[目的]体外克隆牛脂联素基因的编码全序列。[方法]以成牛尾部脂肪的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得牛脂联素基因cDNA的全序列,将其克隆到原核表达载体PMD18-T中,筛选出阳性克隆,提取重组质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。[结果]从牛尾部脂肪组织总RNA中扩增得到671bp的目的条带,该cDNA序列与GenBank中牛脂联素基因序列同源性为100％,其氨基酸同源性也达到100％,确定为目的基因。[结论]该研究为进一步研究牛脂联素基因的功能和研究牛脂联素基因的表达与育肥牛的脂肪代谢的关系提供了试验基础。     

巢式RT-PCR检测昆明小鼠早期胚胎中G6PD基因表达

根据小鼠肌肉的６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）的ｃＤＮＡ序列设计并合成内外２对引物,以巢式ＲＴ－ＰＣＲ方法检测昆明小鼠１－,２－,４－,８－细胞期早期胚盈是否转录出Ｇ６ＰＤ的ｍＲＮＡ,结果发现１￣８－细胞期早期胚胎的ｍＲＮＡ均能以外引物扩增产物为模板通过内引物扩增出一条３７８ｂｐ特异性条带。表明昆明小鼠１￣８－细胞期早期胚胎的Ｇ６ＰＤ基因已表达,磷酸戊糖途径已是其代谢葡萄糖的主要方式之一。     

应用巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别

为获得一种高效的牛胚胎性别鉴定方法,采用高特异性和灵敏度的巢式PCR进行扩增。结果表明:公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255bp的β-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255bp的β-珠蛋白基因片段。巢式PCR只需3～8个细胞就可以观察到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以牛胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

LAMP法在牛早期胚胎性别鉴定中的应用

对LAMP试剂盒的准确性、特异性和灵敏度进行鉴定,同时对11枚体外胚胎和38枚体内胚胎进行性别鉴定。结果表明:血样DNA的鉴定结果与实际性别吻合;LAMP试剂盒的灵敏度很高,且只对牛有特异性;对胚胎样品的鉴定结果与实际性别吻合。     

Development of Bovine Embryos from Two Different Activated-time Oocytes for Parthenogenesis and Two Kinds of Nucleus Donors for Cloning

ＴｈｅａｉｍｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ１ｗａｓｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆｔｗｏｄｉｆｅｒｅｎｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｉｍｅｏｎｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｏｏｃｙｔｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅａｓｐｉｒ...