鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法，将小鼠宰杀在20℃下搁置14h，然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子，与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示，与带有颗粒细胞卵的体外受精率（0％） 透明带切开卵的体外受精率（4％－31％）相比，去透明带卵的体外受精率增至39％－68％（P＜0．01）；体外受精所 2细胞胚，经培养有74％－100％的胚胎发育至扩经囊胚；来自BDF1雄性小鼠精子的2细胞期体外受精胚，经体外培养至囊胚期后再移植，获得了正常新生小鼠，以上结果表明，去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精，可提高小鼠弱精子的利用率。     

小鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法 ,将小鼠宰杀在 2 0℃下搁置 14 h,然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子 ,与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示 ,与带有颗粒细胞卵的体外受精率(0 % )和透明带切开卵的体外受精率 (4%～ 31% )相比 ,去透明带卵的体外受精率增至 39%～ 6 8% (P<0 .0 1) ;体外受精所获的 2细胞胚 ,经培养有 74 %～ 10 0 %的胚胎发育至扩张囊胚 ;来自 BDF1雄性小鼠精子的 2细胞期体外受精胚 ,经体外培养至囊胚期后再移植 ,获得了正常新生小鼠。以上结果表明 ,去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精 ,可提高小鼠弱精子的利用率     

小鼠精子透明质酸酶SPAM1在受精过程中的功能研究

旨在研究小鼠精子透明质酸酶SPAM1(Sperm adhesion molecule 1)对受精过程中精子/卵丘互作的影响,并初步探讨其可能的作用机制。本研究抽提小鼠尾尖基因组,利用PCR法检测小鼠Spam基因型;筛选的野生型(WT)和Spam1敲除(KO)小鼠,提取附睾尾部精子蛋白进行Western blot和酶活性检测;经TYH培养液2h获能后,分别对精子的运动性、穿透和分散卵丘细胞能力及体外受精(IVF)进行统计分析。结果表明,KO小鼠精子中未检测到SPAM1蛋白,透明质酸酶活性也极显著低于WT小鼠(P0.01);而获能后精子运动性,在KO和WT小鼠之间差异不显著(P0.05);与WT相比,KO小鼠精子缺失Spam1后,极显著地影响卵丘细胞层基质中精子顶体反应的发生比率(P0.01),导致精子穿透卵丘细胞层的能力极显著降低(P0.01),仅有少数精子能够到达卵子透明带表面,大量精子极易黏附于卵丘细胞层表面或外部边缘(P0.01);此外,KO小鼠精子IVF 2h的卵丘细胞分散和受精率均呈现显著延迟(P0.05)。综上表明,小鼠精子透明质酸酶SPAM1与顶体反应相关联并影响精子/卵丘互作。揭示SPAM1在穿卵过程中除了具有降解透明质酸的作用外,还存在其他的非酶活性功能。     

猪卵子体外成熟方法研究

本文根据猪卵子带卵丘细胞不同,将卵子分为 A—D4级。实验表明,使用不同成熟培养时间和多次受精法,可以使处于不同发情期的卵子获得较高的体外受精率。B、C、D 级卵子(完整、部分完整或无卵丘)培养32—36小时后受精,体外受精率(2细胞率)25.60％,17.61％和15.78％。A 级卵(放射状卵丘)培养4—15小时后受精,体外受精率62.50～66.67％。在m—KRB 和 m—TCM 199培养液中添加卵泡液和 FSH 或 PMSG 可以促进卵子体外成熟,卵丘扩散成放射状。特别是用即将排卵的猪的大卵泡液和发情黄牛卵泡液,其效果更优。使用这两种培养液的平均受精率分别是19.78％和29.58％,最高30.23％和43.48％。将猪卵子移入小鼠和大鼠子宫角以及兔输卵管中进行卵子成熟培养获得成功,体外受精率分别是10.42％、28.45％和36.36％。     

用精子微注射技术研究获得的对哺乳动物受精过程的新认识

精子微注射技术就是借助显微操作仪,将精子或精子成分直接注入卵母细胞的细胞质或卵周隙中去,使卵子受精。它是体外受精的一种新的操作技术,可将体外受精研究和胚胎的显微操作技术相结合,因而,比常规体外受精研究更有发展前途。首先,它避免了正常受精过程中精子穿透卵子胶膜、卵丘细胞一透明质酸基质和透明带,进而和卵浆膜融合的过程,因而可以对精卵互作的某些特征进行探讨。比如可用以研究受精的准确时间、     

米非司酮对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响

本研究旨在探讨米非司酮（mifepristone,RU486）对小鼠精子穿透卵丘细胞层的影响。分别添加20 μg/mL RU486到精子获能液或穿卵培养液,检测小鼠精子顶体反应发生比率和穿透卵丘细胞层能力。结果显示,添加RU486能够极显著抑制孕酮（P₄,5 μg/mL）诱导的精子顶体反应（P ＜0.01）;并极显著减少穿透卵丘细胞层到达卵子透明带的精子数量及在卵子-卵丘细胞复合体（OCC）中精子发生顶体反应的比率（P＜0.01）;同时添加P₄和RU486情况下,相比单独添加RU486,虽然P₄能够极显著地促进精子穿透卵丘细胞层到达透明带,但对OCC中的精子顶体反应没有明显作用。综上表明,RU486能够抑制P₄诱导的顶体反应并影响小鼠精子穿透卵丘细胞层过程,揭示P₄/孕酮受体（PGR）通路在小鼠精子穿卵过程中具有重要作用。     

不同脱除卵丘细胞方式对牛体外胚胎生产效果的影响

为了提高牛体外受精性控胚胎发育率,试验从体外受精（IVF）培养8 ｈ后的胚胎,采用不同的脱除卵丘细胞方式（机械脱除法、酶脱除法、振荡法）脱除卵丘细胞,研究影响牛性控精液体外受精效率的关键技术。结果表明,在体外受精8 h后,采用不同的脱除卵丘细胞方式（机械脱除法、酶脱除法、振荡法）脱除卵丘细胞,受精卵经体外培养48 h后统计胚胎卵裂率分别为（58.8±2.8）%、（58.5±5.7）%、（69.9±3.4）%,体外培养192 h统计囊胚率分别为（26.7±2.7）%、（26.9±3.9）%、（35.8±4.1）%,由此可见,振荡法显著优于机械脱除法和酶脱除法（P〈0.05）。性控精液体外受精时,体外受精8 h后采用振荡法脱除卵丘细胞对于提高性控精液体外受精胚胎发育率具有重要意义。     

去除卵丘细胞的小鼠卵母细胞体外成熟过程中的超微结构变化

去除卵丘细胞会降低小鼠卵母细胞的成熟质量.利用透射电子显微镜技术观察去卵丘细胞的小鼠卵母细胞体外成熟过程中的超微结构变化,目的是在亚细胞水平上寻找由于卵丘细胞的去除而导致卵母细胞质量降低的原因.结果显示,成熟培养过程中微绒毛逐步从透明带内撤出,并竖直于卵膜表面;卵周隙逐步形成;线粒体由成簇到散布于卵质内;皮层颗粒由多到数量极少.因此,皮层颗粒的减少或继续生成路径的障碍可能是去除卵丘细胞的小鼠卵子成熟质量降低的重要原因.     

小鼠体以精及胚胎发育的影响因素

为了完善小鼠体外受精和胚胎的体外培养系统，以M16为基础培养液，探讨了葡萄糖、磷酸盐、EDTA、谷氨酰胺及β－疏基乙醇等对小鼠体外受精和胚胎体外培养的影响。结果表明，在M16液中添加EDTA和L－谷氨酰胺（mM16液），小鼠的体外受精率由26％提高到51％；当在mM16液中去掉磷酸盐，或添加Hepes，或添加β－疏基乙醇，体外受精率由51％增至62％－74％；mM16液中添加Hepes，或去掉磷酸盐，可阻碍胚胎的体外发育，囊胚的抗张率由80％降至49％和58％，而在无糖mM16液中添加β－疏基乙醇，可显著地提高扩张囊胚率（91％）。以上结果表明、M16液中添加EDTA、谷氨酰胺和β－疏基乙醇后，适用于小鼠体外受精；同时去掉葡萄糖后，则适用于2细胞胚的体外培养。     

牛体外受精胚胎细胞核移植的实验研究

将采自肉联厂屠宰车间的牛卵巢中的卵母细胞置于ＴＣＭ－１９９＋１０％ＥＣＳ（０ｄ）＋ＦＳＨ（１万ＩＵ／Ｌ）＋ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）中培养成熟，用含０．３％透明质酸酶的消化液将卵母细胞周围的卵丘细胞去掉，并以７．５ｍｇ／Ｌ的ＣＢ液处理后，用微吸管吸去透明带内的第一极体及极体下面的部分卵母细胞质，然后将经体外受精并发育至８～１６细胞期胚胎的卵裂球注入去核卵母细胞的卵周隙中，再将移核胚置于电融合槽内进行融合（电场强度为１２００Ｖ／ｃｍ，持续时间为８０μｓ，１次脉冲刺激）。将融合的胚胎移入生长有单层贴壁颗粒细胞的发育培养液（ＴＣＭ－１９９＋１０％牛血清）中培养，观察移核胚的融合率及发育率，部分去核卵母细胞经染色后观察去核率。结果表明：（１）移核胚的融合率为８６．９％（５３／６１）；（２）发育至２～８细胞期的胚胎占培养的移核胚胎总数的２１．３％（１０／４７）；（３）卵母细胞的去核率为６８．２％（４５／６６）。     

小鼠输卵管卵卵龄对体外受精影响初探

本文用昆白小鼠不同卵龄的卵子作体外受精试验，结果表明，新排出的卵细胞尚未成熟，排卵后１－２小时基本成熟，３－４小时充分成熟，５小时后虽有较高受精率，但受精卵继续培养１０小时，大部分退化。     

金黄地鼠体外受精的初步研究

实验用ＴＹＨ、Ｔ６两种培养液做为精子获能培养液和受精培养液进行了金黄地鼠的体外受精。用经获能培养的精子分别与具卵丘和去卵丘的卵子进行受精培养。结果在ＴＹＨ中分别得到了２７．５％和３３．３％的受精率。在Ｔ６中得到了４７．２％和２６．３％的受精率；用未经获能培养的精子分别与具卵丘和不具卵丘卵子进行受精培养，结果在ＴＹＨ中得到了４１．８％和７．１％的受精，在Ｔ６中得到了４８．５％和５７．７％的受精率。实验结果说明：（１）适用于小鼠体外受精的培养液Ｔ６和ＴＹＨ并不适合于金黄地鼠，其主要原因是不能使精子有效获能；（２）卵丘细胞的存在有使受精率提高的趋势；（３）来自不同公鼠的精子的受精能力差异很大，进行体外受精时必须严格挑选公鼠     

哺乳动物精了入卵的分子机制

过去 2 0年内 ,哺乳动物受精分子机制的研究取得了较大进展 ,有关精子入卵的“分子途径”也越来越被人们所认识。本文将就精子入卵机制方面的研究进展作一简要概述。1　精子穿透卵丘细胞层哺乳动物排出的卵子包裹在 30 0 0个左右的卵丘细胞中。这些卵丘细胞在排卵前细胞间间隙增大 ,透明质酸等细胞外基质成分的合成增加。获能精子要与卵子结合 ,首先必须穿过卵丘细胞层。大量研究表明 ,精子头后部具有透明质酸酶活性的膜蛋白ｐＨ - 2 0协助精子穿透卵丘细胞层[1、2、3] 。ｐＨ - 2 0是一种单链蛋白质 ,通过糖基磷脂酰肌醇 (ＧＰＩ)固定在精…     

透明质酸对猪精子活率,获能,顶体反应及体外受精穿透率的影响

采用具有高繁殖力的种公猪的新鲜精液及冷冻精液，加入不同获能剂咖啡因及透明质酸，在３９．５℃、５％ＣＯ２培养箱中孵化培养。结果表明，透明质酸能够在体外条件下保持精子的活率，并维持在稳定的水平，鲜精为４２．６％～４７．８％，冻精为２０．４％～２５．６％。荧光剂Ｈｏｅｃｈｓｔ染色表明，透明质酸能够显著增加培养３６０ｍｉｎ后的活精子率。在无蛋白来源的ｍＢＯ培养液中，培养０～６０ｍｉｎ，精子发生自发的获能和顶体反应，而受获能剂影响，精子发生获能的时间带在各处理组之间显著不同：咖啡因处理组的获能时间带是６０～３６０ｍｉｎ，透明质酸处理组则是６０～１８０ｍｉｎ。体外受精试验表明，去除卵母细胞周围卵丘细胞时，透明质酸和咖啡因对精子穿透率的影响没有区别；而在卵丘细胞存在的前提下，咖啡因处理组的穿透率显著高于透明质酸处理组。     

卵丘细胞与卵母细胞解离对小鼠卵子体外成熟及受精的影响

卵丘细胞与卵母细胞的解离会降低小鼠卵母细胞的成熟质量,该研究将解离所得裸卵用不同种成分明确的成熟培养液进行体外成熟、体外受精、体外发育,从而确定卵丘细胞与卵母细胞的解离对小鼠卵母细胞成熟、受精、发育的影响,并通过筛选建立起最优的试验体系,为去除卵丘细胞的卵母细胞体外成熟质量的提高及后续研究提供参考依据。结果显示,裸卵的成熟率与成熟培养液的选择密切相关,TYH组、HTF组极显著优于M199组、α-MEM组;卵丘细胞与卵母细胞的解离与否对受精率的影响是巨大的,解离后(10%～28%)与解离前(48%～76%)差异极为显著(P<0.01);卵丘细胞与卵母细胞的解离与否对发育率的影响未发现显著差别(P>0.05)。因此,卵丘细胞与卵母细胞的解离主要影响了小鼠卵母细胞的体外受精率,通过选用适当的培养液可以相对改善该情况。     

透明质酸酶对牛卵母细胞孤雌激活的研究

在37－39℃50mL/L CO2条件下，用含80mL/L发情牛血清及50mL/L犊牛血清的M199成熟培养液培养牛的A、B级卵丘－卵母细胞复合体（COCs)，18－22h后以无血清的TCM199培养液洗涤3次，用透明质酸酶消化吹打脱去卵丘细胞，以无血清的M199培养液洗涤3次，移回成熟培养液中培养。结果：卵细胞于成熟后第3d开始出现卵裂，第5d卵裂率达到37％，第9d囊胚率达5％－9％。表明透明质酸酶可以促使成熟的牛孤雌卵母细胞激活并发育至囊胚。     

高产奶牛连续活体采卵及卵母细胞体外受精

在超声波扫描仪的指导下,用双孔型采卵针以 １４．７ ｋ Ｐａ 抽吸压经阴道对 ５ 头高产奶牛分别连续实施 ７ 次活体采卵,每 ７ ｄ １ 次,共采集卵子 ２１４ 个,占可见卵泡数的 ５３．９％ ,每次头均采集卵子 ６．１ 个。卵子经过体外培养、体外受精、体外受精胚体外发育培养,于体外受精后 ４８ ｈ 、１６８ ｈ 统计的卵裂率、囊胚发育率分别为 ７５．２％ 和 ２９．７％ 。研究结果表明,在超声波扫描仪指导下对奶牛连续进行活体采卵是可行的,所得卵子应用体外成熟、体外受精、体外培养技术,可生产用于冷冻或移植的胚胎。     

卵丘细胞对卵母细胞成熟、受精和胚胎发育的影响试验

将从猪卵巢上获取的卵母细胞根据卵丘细胞层数的多少分为两类,并将这两类卵母细胞进行成熟培养、体外受精和孤雌激活,以验证两类卵母细胞的发育潜能.结果显示,将两类卵母细胞分别进行成熟培养时,优级卵的成熟率高于次级卵（67.42±177;1.52％vs 48.33±177;2.85％）,且差异极显著（P＜0.01）;将成熟的卵母细胞进行孤雌激活后,优级卵的囊胚率高于次级卵（58.00±177;2.88％ vs 41.00±177;6.40％）,且差异极显著（P＜0.01）,但囊胚总细胞教两者无显著差异（P＞0.05）;将成熟的卵母细胞进行体外受精后,优级卵的囊胚率、囊胚总细胞数均高于次级卵（18.00土5.70％ vs 4.25±177;2.31％,41.7±177;3.33 vs 36.2土2.10）,且差异极显著（P＜0.01）;进行受精卵孵育时,未去除卵丘细胞的胚胎卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均高于去除卵丘细胞的（88.14土7.48％ vs 58.69±177;2.89％,51.2±177;7.33％ vs 11.92±177;2.29％,41.7±177;3.33 vs 36.8±177;3.15）,且差异极显著（P＜0.01）.以上结果说明：卵丘细胞层数较多的卵母细胞成熟率高,且其孤雌和体外受精胚胎的发育潜能也好;卵丘细胞存在时,有助于卵母细胞的受精及以后的胚胎发育.     

貉受精的细胞学和X射线微区分析研究

应用电子显微镜和Ｘ射线微分析技术，对貉受精过程和受精卵膜元素研究的结果表明，貉卵子的卵丘细胞具有吞噬和过滤功能；卵丘细胞间的精子顶体尚未发生囊泡化，而附着于透明带的精子发生了顶体反应，并以８０°角穿入透明带，在其穿入的前方打开一个通道，最后穿过。穿过透明带的精子以赤道段或顶体后区同卵膜融合，并激发皮质颗粒释放，接着穿入卵内，最终发育成雌、雄原核。原核期受精卵质膜上具有高含量的钙，并呈集团分布，它在皮质颗粒胞吐释放中起着重要作用。     

CR1aa-卵丘细胞共培养牛体外受精卵的卵裂率及囊胚率

牛卵母细胞用5％CS的TCM－199培养液体外成熟培养（IVM）22h；以BO液＋咖啡因作精子获能处理1.5h；BO液＋BSA的培养液体外受精（IVF）5h；受精卵（含卵丘细胞）用5％CS的CR1aa培养液在5％CO2、955空气、38.5℃、饱和湿度的培养环境中体外培养（IVC）7－8d，结果受精卵裂率为72.4%（56.3%－81.0%），囊胚率23.7%(12.5%-40.9%）。