梨花粉自交不亲和基因克隆及其评价分析

【目的】获得梨SFBB新基因全长序列,研究不同SFBB基因参与梨自交不亲和的作用。【方法】设计特异性引物扩增梨SFBB22-gamma基因组DNA全长序列,并对所有已鉴定、能够与梨S-RNase基因一一对应的SFBB基因全长序列进行比较分析。【结果】梨SFBB22-gamma基因编码区序列大小为1191 bp,编码396个氨基酸,ProtParam预测分子质量为45.47 ku,理论等电点4.67,为酸性亲水不稳定蛋白。其中N端包含由50个氨基酸组成的F-box序列,蛋白质二级结构有5个α-螺旋和24个β-折叠。不同梨SFBB基因和对应S-RNase基因在序列变异、基因多态性以及进化特性等方面存在差异。【结论】现有序列数据显示,梨SFBB基因的序列多态性和变异位点均小于S-RNase。梨SFBB基因4个群体中单个群体SFBB-beta基因和对应S-RNase基因在序列特征上最接近;4个梨SFBB基因个体作为整体与对应S-RNase基因序列特征比SFBB-beta基因和对应S-RNase基因序列特征更接近。SFBB-beta基因存在独自参与自交不亲和的可能性,SFBB-alpha以及SF...     

八月酥等14个梨品种自交不亲和基因(S基因)型的鉴定

多数梨品种自花授粉不结实,生产上要合理配置授粉品种才能获得应有的产量。鉴定梨品种的S基因型,能为梨园合理配置授粉品种提供依据。以我国育成的梨品种为试材,利用特异引物PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离及DNA序列分析,鉴定出了14个梨品种的自交不亲和基因型(S基因型),并通过统计部分品种的田间人工授粉的坐果率以及应用荧光显微镜观察异花授粉后花柱内的花粉管生长情况来验证鉴定出的梨品种S基因型的可靠性。这些品种的S基因型为:八月酥S3S16、绿云S3S29、谢花甜S29S34、香茌S1S21、脆绿S3S4、新雅S4S34、雅青S4S34、伊犁红句句S22S28、猪嘴酥S19S22、假直把子S5S19、青魁S1S3、德胜香S3S29、张掖长把S3S29、金坠梨S21S34。     

梨自交不亲和强度不同品种花柱S糖蛋白含量的差异

 提取梨( Pyrus) 自交不亲和强度不同品种花柱可溶性蛋白质, 应用等电聚焦电泳法在凝胶板上分离出S 糖蛋白, 用图像解析法进行定量。结果表明, 花柱总S 糖蛋白含量因品种而异, 自交不亲和强、弱及自交亲和的品种每1 􀀁g 花柱可溶性蛋白中含总S 糖蛋白分别为􀀂1. 3 ng 、0. 7 ~ 0. 9 ng、 0. 7 ng 。不同的S 基因所表达的S 糖蛋白量差异显著, 即使是同一S 基因所对应的S 糖蛋白量也因品种而异。     

京白梨等品种S 基因型鉴定及新基因S28 和S30 的核苷酸序列分析

 根据梨S基因高度保守区C1和C3区, 设计1对引物P1和P2, 对梨品种的基因组DNA进行S基因特异扩增、克隆、测序, 并在GenBank中BLAST比较, 确定S 基因特异性片段, 对京白梨等6个供试自交不亲和品种的S基因型比对结果为: 白梨中的‘库尔勒香梨’为S₂₁ S₂₈ , ‘苹果梨’为S₁₇S₁₉ ; 砂梨中的‘台湾蜜梨’为S₁₁ S₂₂ ; 西洋梨中的‘葫芦梨’为S_a S_b; 秋子梨中的‘京白’为S₁₆ S₃₀ , ‘早梨18’为S₄ S₂₈。其中S₂₈和S₃₀为首次登录的新S 基因, 在GenBank的登录号分别为AY562394 (库尔勒香梨) 和AY876945 (京白) 。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析北大核心CSCD

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

大白菜自交不亲和系S等位基因分析

通过１９９２年对８份、１９９３年对１１份材料进行系内株间和系间的完全双列杂交的亲和性表现，得出２０３９－５（深）、２０３９－５（浅）、胶１、胶２等１１份材料为Ｓ等位基因纯合、稳定的自交不亲和系，这１１份材料中存在７种Ｓ基因型。７２１０３－１（浅）、８１６１和潭（深）３份材料自交不亲和性尚不稳定。     

利用基因芯片鉴定梨品种自交不亲和基因型

根据东方梨中已鉴定的46个S基因序列和S基因的结构特点,设计了86条寡核苷酸探针并制备成S基因寡核苷酸检测芯片,采用Cy3荧光修饰引物标记被检测品种的PCR产物并与芯片杂交,以检测不同品种的S基因型。结果表明：利用芯片与华梨2号、秀玉和德胜香等已知S基因型的品种杂交,杂交信号显示与各品种已知基因型相符合。利用芯片鉴定了丽江黄酸梨等27个未知S基因型的梨品种,获得了各品种的S基因型,随机选取部分品种进行DNA测序和序列分析,结果与芯片杂交结果完全一致,证明利用S基因寡核苷酸芯片鉴定梨品种S基因型结果准确可靠。     

梨配子体型自交不亲和性及其分子机理

综述了梨(Pyrus)配子体型自交不亲和性机理研究的一些进展,主要包括梨自交不亲和性的表现,雌蕊自交不亲和基因(S基因)的表达特性与克隆,S基因蛋白产物(S糖蛋白)的分离、特性鉴定,S糖蛋白的晶体结构与功能,梨S基因型的确定等方面的研究成果,并提出了梨自交不亲和性研究中尚待阐明的问题。     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。     

根癌农杆菌介导的CG1-400-RNase基因转化创制锦橙转基因再生植株

【目的】为了快速有效地利用基因工程的方法获得柑橘无核新种质,【方法】以我国特色多核柑橘优良品种锦橙实生苗上胚轴切段为外植体,采用根癌农杆菌介导法进行能导致种子败育基因CG1-400-RNase的转化;为快速有效地筛选出转化子,在实生苗上胚轴切段转化再生过程中,根据不同发育阶段的组织或器官对抗生素的敏感程度不同采用不同的选择压。【结果】结果表明,在抗性芽再生过程中卡那霉素质量浓度设定为50 mg.L-1,获得的362个抗性芽转入卡那霉素质量浓度为100 mg.L-1的伸长培养基中进行伸长培养后,进行早期PCR检测,获得28个阳性芽;经过不定芽诱导生根或试管嫁接,获得22株完整植株。【结论】再生植株经PCR和Southern杂交检测,获得2株目的基因以单拷贝的形式插入锦橙基因组的转基因植株,为最终获得具有无核性状且可稳定遗传的柑橘新种质奠定了基础。     

砀山酥梨和秋白梨酚类物质UPLC–PDA–MS/MS–ESI分析

采用超高效液相色谱—二极管阵列—串联四级杆质谱联用法(UPLC–PDA–MS/MS–ESI)对砀山酥梨和秋白梨果皮、果肉和果心(不含种子)中的酚类物质进行了分析。结果表明,两个品种检出42种酚类组分。大多数酚类物质在果皮中含量最高,仅绿原酸和Z–咖啡酰奎尼酸在果心最高。果皮中的酚类物质种类最多,砀山酥梨果皮中含有5大类42种;秋白梨果皮中含有4大类30种,砀山酥梨比秋白梨多7种黄酮类组分和3种槲皮素糖苷类物质。在果心和果肉中未检出黄烷醇类、黄酮醇类和黄酮类物质。在砀山酥梨果皮中鉴定出其他梨果实中尚未见有报道的芹菜素7–O–芸香糖苷,在砀山酥梨和秋白梨果皮中鉴定出原花青素B1和B2两种原花青素二聚体和原花青素C1及暂命名的C-1、C-2和C-3等4种原花青素三聚体。     

辣椒花器官发育MADS-box基因的克隆与表达分析

采用RACE技术从辣椒（Capsicum annuum L.）花药中获得了一个控制辣椒花器官发育的MADS-box基因,命名为PPI（GenBank登录号：GU812276）。该基因全长952 bp,编码215个氨基酸,具有典型的MADS结构域和K结构域,与番茄花器官发育MADS-box基因TPI高度同源,同源性达88%。系统进化树分析表明,PPI基因属于花器官发育B类基因。RT-PCR表达分析表明,该基因在辣椒花瓣中的表达高于在花药、萼片以及子房等花器官中的表达,在营养器官叶片中没有表达。     

鸭梨芽变优系主要器官性状研究

采用田间观察和室内分析相结合的方法,对2个鸭梨芽变优系(巨鸭梨、光鸭梨)的生物学及遗传学性状进行研究,为培育鸭梨新品种奠定基础。结果表明:巨鸭梨:果实巨大,花朵较大,花瓣数目多,花粉粒较长;叶片和栅栏组织均较厚,叶片叶绿素含量和净光合速率都较高,属于鸭梨特大果新品系。光鸭梨:果面洁净(果点稀而大,果面锈斑面积小),果肉质地细腻而酥脆,酸味较浓;枝条皮孔和叶片气孔密度均较小;果实成熟期比普通鸭梨晚约7 d。属于外观品质和内在品质俱佳的鸭梨优质新品系。与普通鸭梨相比,巨鸭梨雄蕊多出1条Rf 0.206酶带,而少了1条Rf 0.556酶带;光鸭梨未展叶雏梢多出了2条酶带(Rf 0.079和Rf 0.127),Ф1 cm的幼果多出1条活性较强的Rf 0.560酶带,Ф2 cm的幼果少了1条Rf 0.860酶带。巨鸭梨和光鸭梨既有与普通鸭梨共同的遗传基础,又有一定的遗传差异,是鸭梨新的变异类型。     

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。     

梨20个品种S基因型的鉴定及新S-RNases基因克隆

 为了鉴定我国梨品种和一些野生类型个体的S基因型,应用S-RNase特异PCR扩增、克隆和测序,对其S-RNases基因核苷酸序列进行分析,鉴定了20个梨品种和野生类型个体的S基因型。起源于我国的'奥连'(S_pS₃₂)、'吊蛋'(S_dS_e)、'沙疙瘩'（S₃₆S_d）品种和杏叶梨的一个类型（S₂₂S_c）个体中存在西洋梨的S-RNase基因,证明S-RNase基因分化是在东方梨种群和西方梨种群的各个种形成之前。在秋子梨的'麦梨'、'内蒙古山梨'中发现了2个新S-RNases基因,命名为S₄₀-、S₄₁-RNase（DQ903313、DQ988687）。S₄₀-和S₄₁-RNase基因推导的部分氨基酸序列分别与苹果属S₁₁-和S₆-RNase的同源性为100%和94.4%,这表明S-RNase的存在可能在梨属和苹果属形成之前。     

梨属种质资源的RAPD分析

 对梨属40 个品种及类型进行了RAPD 扩增, 根据相似系数进行UPGMA 法聚类,将起源于欧洲的西洋梨与起源于中国的3 个种明显区分开, 起源于中国的3 个种虽未完全各自聚类, 但各材料间都有不同的遗传距离, 证明RAPD 技术可作为梨种质分类鉴定的依据。