梅花鹿鹿茸真皮层细胞的分离培养及冷冻保存

为了研究梅花鹿鹿茸真皮层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端的真皮层组织,分离真皮层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明,在含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸真皮层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈长梭形或菱形,细胞的生长状况良好,传代培养的细胞培养5d可长至汇合。传4代以前的细胞形态均一,边缘光滑,胞质均匀透明,细胞排列紧密;传5代后,细胞伸展变为扁平形,细胞突起增多,边缘不光滑,汇合后细胞排列疏松。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,真皮层细胞复苏后的存活率较高。     

嵌合猪圆环病毒对仔猪的致病性与免疫原性

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的致病性与免疫原性,检测了健康普通仔猪接种PCV1-2后的临床症状、病理变化、血清与组织中的病毒含量及血清学变化。结果显示,仔猪接种PCV1-2后增重和饲料转化效率未受影响,未出现可见的临床症状和大体病理变化,仅部分出现轻微的组织病理变化。血清中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白抗体在接种后第14天出现阳转,第28天时抗体阳性率达到100%,表明PCV1-2诱发仔猪快速产生了针对PCV2 ORF2蛋白抗原的特异性抗体反应。荧光定量PCR结果显示,血清中PCV1-2 DNA含量在接种后逐渐上升,第28天时达到最高,之后迅速下降;第35天宰杀时组织中病毒含量以肺门淋巴结中最高,心脏中最低;而常规PCR难以检出血清和组织中的PCV1-2 DNA,表明PCV1-2接种后只引起仔猪的轻微感染。研究数据表明,PCV1-2对仔猪具有良好的免疫原性,其致病性明显减弱。     

福建省猪流行性腹泻流行病学调查

为探求2012-2013年猪流行性腹泻病毒（PEDV）在福建省的流行情况,本研究采用RT-PCR方法对采自福建省125个规模猪场的257份发生腹泻病料进行PED病原检测,并分析PEDV致猪群的发病情况。结果：被检病料PEDV的阳性率为63.04%（162/257）,能导致不同阶段猪群发病,尤其是对哺乳仔猪的发病率最严重,死亡率高达100%。表明：PEDV在我省发病仍较为严重,应加强防控,以减少损失。     

猪嵴病毒福建株结构蛋白VP 基因的克隆与生物信息学分析

为丰富猪嵴病毒结构的分子流行病学数据,明确福建株猪嵴病毒结构蛋白VP的特征,研究运用RT-PCR方法设计特异性引物,对猪嵴病毒结构蛋白进行分段扩增后进行克隆测序,并将测序结果进行拼接后进行生物信息学分析。结果表明,所扩增福建株猪嵴病毒含有完整的结构蛋白VP,其基因全长为2529 bp,编码有843个氨基酸,理论等电点为5.34,理论分子质量为89.603 kD,不稳定系数为37.71,最大疏水指数为2.522,最小疏水指数为-2.622。其和XX株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最高,仅为86.7%,与swine/S-1-HUN/2007/Hungary株猪嵴病毒结构蛋白核苷酸同源性最低,为83.7%。从遗传进化上看,猪嵴病毒结构蛋白在遗传进化上呈现2个独立的分支,中国猪嵴病毒分离株在2个遗传分支上均有分布。     

猪圆环病毒的分子生物学检测

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV-2)基因组序列,利用Primier5设计了一对特异性引物,分别采用CTAB法和DNA试剂盒提取猪脾脏总DNA,用PCR方法扩增猪PCV-2基因保守区序列,并对PCR扩增程序进行优化,对PCR检测方法的敏感性、重复性做了研究。结果显示扩增的目的片段约为573 bp,94°C 30 sec,60°C 30 sec,72°C 30 sec,30个循环扩增效果最好;模板DNA最低稀释倍数为100倍,即能检测到最低模板DNA的质量为25.8 ng;同一组织不同部位PCR检测的重复性较好;该检测方法为PCV-2的快速检测提供了方法和依据。     

猪胆汁中猪去氧胆酸提取工艺条件的研究

以猪胆汁为原料,初步研究了乙酸乙酯添加量、处理温度、处理时间3个因素对猪去氧胆酸(HDCA)提取率的影响。结果表明,当乙酸乙酯添加量为猪胆粉质量的8倍,处理温度80℃,处理时间2h,HDCA的提取率为93.15%。     

猪繁殖与呼吸综合征核酸疫苗研究进展

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是威胁世界养猪业的最主要的疾病之一,每年都给养猪业带来巨大的经济损失。目前,世界上还没有对PRRS确实有效的防控措施,免疫预防是防控的主要手段。基因工程疫苗是现在疫苗研究的重点,特别是核酸疫苗不仅能引起体液免疫和激发较强的细胞免疫,而且其生产工艺简单,稳定性好,成本低,便于贮藏,不具有感染性,不会出现毒力返强等安全问题。现在对 PRRS核酸疫苗的研究已初具成效,现就核酸疫苗的研究进展进行综述。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

组织蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外发育能力的影响

为探明外源性组织蛋白酶抑制剂(E-64)对猪卵母细胞体外发育能力的影响,通过向成熟液中添加1、5、10μmol/L的外源性组织蛋白酶抑制剂,对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养46 h,统计第一极体率,随后分别进行体外受精和孤雌激活,统计第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果表明,成熟液中加入1μmol/L E-64的第一极体排出率显著高于未添加的对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组。将体外成熟的卵母细胞进行体外受精及孤雌激活,体外受精后胚胎的卵裂率与囊胚率结果均为成熟液中加入1μmol/L E-64的添加组显著高于对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组;孤雌激活后,4组间胚胎的卵裂率差异不显著,囊胚率为10μmol/L E-64的添加组显著低于其他3组。因此1μmol/L E-64能促进猪卵母细胞的核成熟,并能进一步提高其体外受精后的卵裂率和体外培养的囊胚率。     

猪圆环病毒2型间接ELISA方法的建立

为了猪圆环病毒2型（PCV2）抗体,本研究建立了快速、敏感的ELISA诊断方法。本研究应用原核表达的PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,通过抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的确定,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,然后进行特异性测定、重复性测定和符合率比较等,建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果显示,建立的间接ELISA方法只能检测出PCV2阳性血清;3次重复性试验的差异不显著;与韩国JBT公司的PCV2试剂盒的符合率达到了92.5%;对采集福建省内多个猪场204份血清样品进行检测,其阳性率达到了76.5%。实验表明,建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法具有特异性强、重复性和稳定性好的特点,可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。     

不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响。IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-S1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重。结果显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21 ku。Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG 佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常。ISA 71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256。ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗。     

猪干扰素IFNE1基因克隆及重组表达载体的构建

依据电子延伸序列设计一对克隆引物,用RT-PCR法从猪胃组织扩增出猪干扰素epsilon 1(IFNE1)基因的完整编码区并进行序列分析;再根据克隆的序列设计一对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含EcoRI/XhoI酶切位点的猪IFNE1片段,插入原核表达载体,转化至宿主菌,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白。结果表明,克隆的猪IFNE1基因包含完整的开放阅读框架,长为586 bp,ORF为582 bp,编码193个氨基酸,与人、小鼠的同源性分别为83.6%和69.2%,推测的氨基酸序列与人、小鼠的同源性分别为76.2%和55.2%,表达的融合蛋白分子量约为47 kDa。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中非甾体抗炎药残留量

研究建立了猪肉中美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬和托芬那酸四种非甾体抗炎药残留量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。样品中残留的药物经乙腈提取,提取液浓缩后用乙腈-0.1%甲酸水溶液溶解,正己烷液-液分配净化,最后采用电喷雾串联质谱仪在正离子多反应监测扫描（MRM）模式下进行测定,基质外标法定量。四种药物在各自的线性范围内,线性关系良好,相关系数均为0.999。对猪肉中美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬和托芬那酸在定量限（LOQ）、2.5 倍定量限（2.5 LOQ）和5 倍定量限（5 LOQ）三个添加浓度水平下的回收率进行测定,其平均回收率在在72.1%和87.3% 之间,相对标准偏差在2.8%和6.7%之间。美洛昔康、氟尼辛、卡洛芬和托芬那酸的定量限(S/N≥10)分别为1.6、1.6、80 和8.0 μg/kg。该方法不使用固相萃取柱,简化了操作步骤,节约了检测成本,灵敏度、准确度和精密度均符合多残留检测技术的要求,可为猪肉中非甾体抗炎药残留量的测定提供技术支持。     

猪圆环病毒1型天津株全基因组的克隆与序列分析

摘要：【目的】从天津地区分离和克隆出1株PCV1,并进行基因组序列分析。【方法】参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从天津一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。【结果】全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长1759 bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性达98.2%以上。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别为97.5%~99.8%和92.7%~99.9%。【结论】虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但还是呈现出一定的地域相关性。     

上海梅山猪封闭群内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为检测分析上海梅山猪携带猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的情况,为该猪种作为器官移植供体的生物安全性提供现实依据,笔者从上海嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪封闭群内随机采集45头猪的耳组织,并构建耳成纤维细胞系,利用PCR检测PERV前病毒核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因组DNA,利用RT-PCR的方法检测mRNA表达状况。结果发现被检测的45份样品均携带完整的3种亚型的PERV前病毒DNA;RT-PCR结果显示,45份样品中有40份同时有PERV-A和PERV-B两种亚型的表达,还有5份样品仅检测到PERV-B亚型的表达,未检测到PERV-C亚型的表达。鉴于生物安全性方面的考虑,该猪种能否作为人异种移植的供体仍有待进一步商榷。     

一例猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR诊断与防制

2008年3月,新乡市某猪场发生了以一种经产母猪和初产母猪流产、死产、产木乃伊胎、死胎及弱仔为特征的疾病。采集流产胎儿和死胎的肺、肝、脾脏等病料,制悬液,取上清,进行细胞培养,观察细胞病变。另根据猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株VR-2332 ORF7基因序列设计一对特异引物,提取流产胎儿的肺、肝等组织中PRRSV的RNA,经RT-PCR扩增,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒为阳性,结合病史和临床症状,诊断为猪繁殖与呼吸综合征。通过对该猪场采取紧急接种疫苗、彻底消毒等综合防制措施,控制了该病的流行与蔓延。     

PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化

用猪圆环病毒2型（PCV2）感染40日龄健康长白仔猪,于感染后3、7、14、21和35天宰杀,收集皮肤源树突状细胞（DC）。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈相关分子（LMP7,UBP,MHC-I,calreticulin）mRNA水平的变化进行定量分析。结果显示,LMP7转录水平在感染后3天显著下调（P < 0.05）,UBP转录水平始终上调,其中在21天和35天显著上调（P < 0.05）,MHCⅠ转录水平在7 天显著下调（P < 0.05）,calreticulin转录水平虽有所上调,但差异不明显。以上结果表明,PCV2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。     

DNA免疫法制备猪圆环病毒2型ORF3抗体

为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。     

猪细环病毒k2型福建株ORF2基因克隆

为丰富福建省猪细环病毒的分子流行病学数据,本研究根据猪细环病毒1a型、1b型和k2型特异性检测引物对临床顽固性腹泻仔猪病料组织进行PCR检测,结果从1例病料中检测到猪细环病毒k2型阳性。并通过设计猪细环病毒k2型ORF2基因特异性引物对阳性病料扩增后进行克隆测序,获得猪细环病毒k2型ORF2基因完整编码区序列。分析发现所克隆的猪细环病毒k2型福建株ORF2基因全长为203 bp,编码有67个氨基酸。本实验株ORF2基因和猪细环病毒k2型代表株德国家猪分离株2p株(Gen Bank登录号AY823991)核苷酸同源性高达97.5%;和猪细环病毒1a型(Sd_TTV31株)和1b型(1p株)代表株核苷酸同源性均低于50.0%,分别为43.9%和47.3%。从遗传进化关系上看,本实验株ORF2基因和Gen Bank中猪细环病毒k2型处于同一遗传进化分支,而猪细环病毒1a型和猪细环病毒1b型均处于其他遗传分支。本研究首次在福建猪群中检测到猪细环病毒k2型感染。     

果蔬作物生物技术研究进展

生物技术的发展为果蔬作物的改良提供了新的途径。综述前人应用成果,概述细胞工程、基因工程及分子标记在作物改良中的应用研究进展。