利用RNAi技术沉默东方粘虫V-ATP酶H亚基研究

昆虫V-ATP酶(vacular-type ATPase)是以ATP为能量跨膜转运H+的质子泵,对其亚基进行干扰都会影响ATPase的活性,进而影响昆虫的生理生化指标。本研究利用特异性引物通过RT-PCR法扩增东方粘虫(Mythimna separata)V-ATPase H亚基的2个片段,合成相应dsRNA,通过显微注射导入3龄粘虫体内,观察试虫表型及存活情况,RT-PCR检测试虫体内H亚基的表达。结果表明,注射粘虫V-ATPase H亚基的dsRNA能够显著降低粘虫中肠V-ATPase H亚基的表达水平,直至导致目的基因沉默和粘虫死亡。本项研究成功实现东方粘虫体内V-ATPase H亚基基因沉默。     

蝴蝶兰液泡型ATP酶E亚基基因的克隆及序列分析

E亚基是液泡型ATP酶(V-ATPase)多亚基复合体的重要组成部分,响应植物的非生物胁迫,对其基因的克隆及分析有助于阐释其逆境条件下的分子调节机制。根据蝴蝶兰低温诱导差异蛋白的序列设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰叶片中克隆获得2条V-ATPase E亚基的c DNA序列,分别命名为Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb,Gen Bank登录号分别为KT758849和KT758850。Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb全长分别为960 bp和1 036 bp,二者均具有687 bp的开放阅读框,编码228个氨基酸,包含相同的v ATP-synt_E保守域;生物信息学分析表明,2个序列编码蛋白具有相似的二级结构和相同的亲水性,预测的三级结构也相同。系统进化树分析显示,蝴蝶兰Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb与单子叶植物液泡型ATP酶E亚基距离最近。     

东方粘虫中肠V-ATPase H亚基原核表达及纯化

对东方粘虫Mythimna separate(Walker)中肠V-ATPase H亚基基因(VATPH)进行克隆、原核表达及纯化。首先采用RT-PCR技术克隆基因,再构建原核表达载体(pET15b-VATPH)并转入E.coil BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用Ni-NTA柱及S-200分子筛纯化,最后进行SDS-PAGE分析。结果表明,pET15b-VATPH可高效表达V-ATPase H亚基,纯化后可获得单一条带且分子质量约为55ku的重组蛋白。该结果为进一步研究V-ATPase H亚基的晶体结构,药物小分子与H亚基大分子的相互作用,尤其是以H亚基为筛选模型创制新农药奠定基础。     

双价RNA干扰载体的构建及dsRNA体外饲喂褐飞虱的研究

RNA干涉作为一种重要基因沉默技术,已广泛用于昆虫基因功能的研究。通过人工饲喂或显微注射dsRNA介导RNAi在许多昆虫中取得了成功。为利用RNAi技术进行褐飞虱防治研究,本试验通过重组PCR,获得了编码V-ATPase D亚基和编码V-ATPase H亚基基因片段的融合基因,在此基础上构建了该融合基因发夹结构的RNAi表达载体,通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的表达下降和死亡率的增加。因此双价RNAi载体的构建为利用RNA沉默技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础。     

乙酰辅酶A羧化酶的结构·功能及基因的研究进展

乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）属于生物素包含酶类型Ⅰ,在生物体内催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A。在植物中乙酰辅酶A羧化酶主要有异质型和同质型2种;在动物中乙酰辅酶A羧化酶属同质型,分为ACC1和ACC2 2种类型。主要介绍了分布于双子叶植物以及非禾本科单子叶植物的质体中的异质型ACCase的亚基组成、结构、功能及其编码基因。ACCase由生物素羧化酶（Biotincarboxylase,BC）亚基、生物素羧基载体蛋白亚基（Biotincarboxyl Camer Protein,BCCP）、羧基转移酶的α-CT亚基和β-CT亚基4种亚基构成,有3个功能结构域,即BC功能结构域、BCCP功能结构域以及CT功能结构域。除β-CT亚基由质体基因编码外,其他亚基由核基因编码,在细胞质中合成后转运到质体中组成功能蛋白,参与脂肪酸的合成。     

家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征

【目的】鉴定家蚕（Bombyx mori）中的空泡型ATP酶（vacuolar-type ATPase, V-ATP酶）A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下降到酸性环境,前部丝腺也为酸性环境。进一步对V-ATP酶A、B亚基编码基因在上蔟期丝腺不同区段进行表达情况分析,发现V-ATP酶A、B亚基基因在前部丝腺和中部丝腺前区高量表达,推测V-ATP酶可能与这两个区域低pH环境的产生和维持相关。【结论】明确了V-ATP酶在家蚕各组织的表达情况,V-ATP酶可能与中部丝腺前区和前部丝腺腺腔的酸化相关,这为进一步研究V-ATP酶的生理功能提供了理论依据。     

双价RNA干扰载体转基因水稻抗飞虱研究

借助转基因技术,培育稳定遗传表达靶向昆虫基因dsRNA的转基因植物,对于防治刺吸式害虫褐飞虱具有潜在意义。研究在已获得V-ATPase D和V-ATPase H亚基基因片段的融合基因,并通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致死亡率增加的基础上,构建了该融合基因的pcambia 1300-Ubi-hp(VAD-H)-RNAi植物表达载体,转化日本晴水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica cv.11)获得转基因植物,褐飞虱若虫取食转基因植株后飞虱体内靶标基因的转录水平有所下降,同时飞虱发育历期和世代周期有所延长,虽然没有造成飞虱的死亡,但双价RNAi载体的构建为利用RNAi技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础,同时通过技术改进提高RNAi抗飞虱水平,可进一步培育出抗飞虱转基因水稻。     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Bta4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析。获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2090bp,其开放阅读框编码564个氨基酸。根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Bta4（GenBank注册号为EF590120）。Bta4编码的α亚基含有2个结构域：N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸（α亚基特征序列）、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区。研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义。     

拟南芥染色质重塑因子AtBRM和AtSWI3C基因的克隆及生物信息学分析

非生物逆境如盐渍、干旱等严重影响植物的生长发育,越来越多的证据表明染色质重塑参与植物响应逆境胁迫,并在该过程中起到重要作用。研究逆境胁迫下植物体内的染色质重塑因子基因表达及信号传导网络调控机制对于阐明植物的逆境响应反应及培育耐逆性作物具有重要的理论和现实意义。对拟南芥SWI/SNF染色质重塑复合体亚基AtBRAHMA(AtBRM)和AtSWI3C进行初步研究发现,AtBRM和AtSWI3C均含有核定位信号,AtBRM蛋白具有SNF2_N结构域,为ATPase亚基;同时,AtBRM还含有维持蛋白与组蛋白相互作用的BROMO结构域和维持蛋白蛋白间作用的QLQ结构域,而AtSWI3C则含有与DNAbinding的相关结构域;二者的启动子区域均包含与ABA调控和非生物逆境胁迫相关的顺式作用元件。     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Btα4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析.获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2 090 bp,其开放阅读框编码564个氨基酸.根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Btα4(GenBank注册号为EF590120).Btα4编码的α亚基含有2个结构域:N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸(α亚基特征序列)、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区.研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义.     

小麦高分子量谷蛋白亚基的遗传及其与品质关系的研究

以晋麦50为母本,Gabo为父本组合杂交,研究了其F2子粒的高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)的遗传规律,亚基和亚基组合与蛋白质含量及Zeleny沉降值的关系。结果表明:Glu-B1b与Glu-Bli、Glu-D1d与Glu-D1c的遗传符合一对相对基因的分离规律;蛋白质含量与亚基组合相关不显著;所研究的亚基中5+10亚基对沉降值的贡献大于4+12亚基,7+8亚基对沉降值的贡献大于17+18亚基,5+10亚基对沉降值的贡献最大。     

稻瘟病菌分泌复合物的生物信息学分析及MoSec15定位研究

利用稻瘟病菌分泌途径相关的调控因子分泌复合物进行生物信息学分析及相关基因定位初探．经同源比对获得稻瘟病菌中分泌复合物8个亚基的同源蛋白,通过在线工具分析蛋白结构域、构建系统进化树、预测亚细胞定位;利用公共数据库获得其在稻瘟病菌不同组织和发育阶段的表达情况;此外,亚细胞定位分析表明,稻瘟病菌分泌复合物亚基MoSec15可能定位于菌丝体的内膜结构中．     

水稻OsZFP互作蛋白的筛选与鉴定

CCHC型锌指结构蛋白Os ZFP参与调控水稻Oryza sativa侧根的生长发育,但其相关互作蛋白及调控机制未知。以水稻‘日本晴’‘Nipponbare’为试验材料,克隆了Os ZFP基因,利用Eco RI和Sal I酶切位点构建酵母双杂交钓饵表达载体p GBKT7+Os ZFP,验证该表达载体对酵母菌株Y2H无毒性及报告基因自激活现象;采用酵母双杂交技术,从已构建的水稻c DNA文库中筛选到1个阳性互作蛋白,经美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)同源性比对,鉴定为含有T-complex polypeptide 1(TCP-1)结构域的分子伴侣蛋白第7个亚基(Os06g0687700),命名为chaperonin containing TCP-1 eta subunit(CCT-eta),进而通过酵母一对一回复验证该互作蛋白。基于CCT-eta亚基与Os ZFP蛋白互作,推测分子伴侣蛋白亚基CCT-eta可能参与调控水稻侧根的生长发育。     

与GyrA相互作用的GyrB结构域突变对结核分枝杆菌螺旋酶功能的影响

DNA螺旋酶中的GyrA与GyrB亚基只有互作重组后才有酶活性。为寻找GyrB亚基和GyrA亚基相互作用的关键区域,构建了不同的GyrB亚基突变体,分析GyrB各突变体与GyrA亚基的相互作用对全酶活性的影响。结果显示:GyrB亚基C端是其与GyrA相互作用的主要结构域,结合GyrB的二维结构,提出GyrB中第531~550位氨基酸是影响螺旋酶功能的关键区域,并可能是理想的新药设计靶标。     

编码Glu-A3位点低分子量麦谷蛋白亚基的基因在山东小麦中的分布

低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）赋予面团延展性，对小麦加工品质有重要影响。本试验以545份山东小麦为材料，采用特异引物PCR技术对其Clu-A3位点低分子量麦谷蛋白的7个亚基基因进行了鉴定和分析。结果表明：地方品种中，g亚基的含量最丰富，达到52.3％，历史品种中，c、d亚基的含量较丰富，分别为47.0％和25.2％，与地方品种相比，历史品种中a、c、d亚基所占比例的提升幅度较大，而g亚基的比例则大幅减低。     

草地贪夜蛾V-ATPase亚基E、F、G和H基因的克隆与表达分析

【目的】液泡型ATP酶（vacuolar-type proton ATPase, V-ATP酶）维持着适合真核细胞内膜室生化功能的pH环境。本研究旨在克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda V-ATP酶V₁结构域E、F、G和H亚基基因,并对其时空表达谱进行分析。【方法】采用RT-PCR技术克隆了草地贪夜蛾V-ATP酶E、F、G和H亚基基因,通过实时荧光定量PCR技术测定了其在草地贪夜蛾不同发育阶段的表达动态。【结果】V₁结构域E、F、G和H亚基在鳞翅目昆虫之间具有高度保守性,且均与斜纹夜蛾Spodoptera litura同源性最高。E～H亚基在草地贪夜蛾所有发育时期均有表达,且都出现了在卵期和蛹期表达量低,雄成虫中高量表达的现象,同时不同的亚基在不同发育阶段表达量又有差异。【结论】本研究克隆了草地贪夜蛾V-ATP酶E、F、G和H亚基基因,明确了其在不同发育阶段的表达水平,为进一步研究基因功能以及筛选分子靶标奠定了基础。     

利用Aroona近等基因系研究高分子量麦谷蛋白亚基对面包加工品质的影响

【目的】低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）以Glu-A3c、Glu-B3b、Glu-D3c为背景,明确不同高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）对面团流变学特性、贮藏蛋白组份含量和面包加工品质作用大小。【方法】在新疆乌鲁木齐和石河子种植以澳大利亚小麦品种Aroona作为轮回亲本培育的近等基因系（NILs）,并测定其粉质仪、拉伸仪、贮藏蛋白组份含量和面包加工品质等参数。【结果】HMW-GS对延展性效应不显著,对面团强度效应大小为Glu-D1＞Glu-B1＞Glu-A1;就单个亚基对而言,7+9、17+18和5+10面团强度最大;亚基组合1、7+9、5+10具有最大面团强度,2*、7+9、2+12和1、7+9、2.2+12具有最好的延展性。HMW-GS对不溶性谷蛋白聚合体百分含量（%UPP）效应大小为Glu-D1＞Glu-B1＞Glu-A1;就单个亚基对而言,7+9、17+18和5+10的%UPP最高;亚基组合1、7+9、5+10具有最高的%UPP。HMW-GS对面包总分效应大小为Glu-D1＞Glu-A1＞Glu-B1;就单个亚基或亚基对而言,1、2*、2+12和5+10具有最高的面包总分;亚基组合1、7+9、2+12面包总分最高,1、7+9、5+10次之,null、7+9、2+12最低。【结论】在相同LMW-GS（Glu-A3c、Glu-B3b、Glu-D3c）背景下,HMW-GS对面团强度、%UPP和面包加工品质影响较大,对延展性影响较小;单个亚基或亚基对1、2*、7+9、17+18和5+10对小麦品质影响较大;亚基组合1、7+9、5+10可作为品质改良的最佳组合。     

小麦微核心种质Glu-A3位点等位基因的鉴定及其与品质关系的研究

低分子量麦谷蛋白亚基约占小麦谷蛋白的80%,对小麦品质影响很大,为明确各亚基与品质的关系,促进小麦育种工作,采用PCR方法检测190个中国小麦微核心种质Glu-A3位点等位基因。结果表明:共检测到Glu-A3a~Glu-A3g 7种基因类型,且以等位亚基c为主。SDS沉降值测定显示,c亚基对品质作用较小,但所占比例最大。由此可见,我国小麦种质资源以劣质亚基为主,引进优质亚基可成为我国小麦品质改良的重要途径。     

白刺盐碱胁迫相关基因片段的克隆与分析

采用mRNA差异技术分离白刺盐碱胁迫相关基因片段,得到27个与白刺盐碱胁迫相关的基因片段,并且对它们的同源性进行了研究与分析。结果表明：有6个片段(A1013b,G388,G1013c,G1013c,C391a,C391a)分别与多种植物盐相关基因存在一定的同源性。基因片段C391a与多种植物如香树、烟草等叶绿体光系统亚基A(PsaA)有较高的同源性(86％～94％)。     

浙江省水稻“两迁”害虫发生特点及防控建议

“两迁”害虫是影响水稻安全生产的重大害虫,常年在浙江发生较重。对近年来“两迁”害虫在浙江的发生规律和特点进行分析认为,“两迁”害虫发生量与迁入时间等密切相关,迁入早、迁入峰次多,则虫量大,为害严重,反之亦然。另外,虫量还受气候条件影响,年度间发生程度差异较大。据此,提出了优化栽培管理、加强监测预警、推进绿色防控、科学合理用药的防控建议。