利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

[目的]生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据.[方法]根据O...     

CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现,是适应性免疫系统的一部分,现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达.同时,CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制,确定药物开发的靶标,并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究.对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展...     

利用 CRISPR/Cas9 技术定向编辑水稻 OsIQD1 基因

【目的】植物特异性 IQD 家族蛋白质是一类植物特有的钙调素结合靶蛋白,在植物的生物防 御和发育调节中发挥重要作用。前期酵母双杂筛选试验表明,Pik-H4 与 OsIQD1 存在互作关系,为进一步 揭示 OsIQD1 在水稻抗稻瘟病中的生物学功能,利用 CRISPR/Cas9 编辑技术对 OsIQD1 基因进行定点编辑。 【方法】通过序列比对获得水稻 OsIQD1。在 OsIQD1 第 1 外显子和第 5 外显子（DUF4005 结构域）区域设计 2 个 20 bp 的编辑靶点,将 2 个靶点核苷酸片段克隆至 pRGEB32 载体,获得 pRGEB32-OsIQD1-gRNA 载体,利用 农杆菌介导法转化水稻 Pik-H4 NIL 愈伤组织,经再生培养、潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对 T0 代转基 因植株靶点区域序列进行 PCR 和测序,分析 osiqd1 的突变类型。【结果】转基因再生植株经过对抗潮霉素基因 HPT Ⅱ的 PCR 鉴定,获得 30 株阳性株系。对 T0 代植株靶点附近序列的测序结果表明,OsIQD1 基因被成功编 辑,两个位点的编辑效率分别为 21.67% 和 26.67%,其中,靶点 2 区域有 1 个纯合突变株系。【结论】研究结 果为进一步利用 osiqd1 突变体开展其参与钙离子 / 钙调素信号转导通路的机制研究提供了遗传材料,初步推定 OsIQD1 参与植物的基础免疫反应。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建水稻OsPUX2突变体

[目的]U-box蛋白是一类决定靶标蛋白特异性的E3泛素连接酶(少部分属于泛素链聚集因子-E4),在植物抗病、抗逆和生长发育各阶段都发挥着重要作用。为揭示U-box蛋白家族基因OsPUX2在水稻防御反应中的具体生物学功能,利用CRISPR/Cas9编辑技术对OsPUX2基因进行编辑。[方法]在OsPUX2第1外显子设计1个20 bp的编辑靶点,构建了OsPUX2基因敲除载体pRGEB32-OsPUX2-gRNA载体,并通过农杆菌介导的转化方法侵染水稻Pik-H4 NIL愈伤组织,经潮霉素检测获得转基因阳性植株,并对T₀代转基因植株进行靶点区域序列进行PCR和测序分析,分析ospux2的突变类型。[结果]成功获得了ospux2的敲除突变体材料,对突变类型的分析发现,转基因编辑后代共存在7种突变类型,以缺失突变为主,其中一种纯合突变类型在OsPUX2第一个外显子的第115号碱基处缺失了一个C碱基,导致蛋白的翻译在第84个氨基酸处提前终止。[结论]该研究获得ospux2突变株系对进一步研究该基因的功能具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻OsIAA11

[目的]OsIAA11参与的生长素信号途径在水稻生长发育阶段和环境因子响应中起重要作用,并影响水稻生育后期的产量形成过程.利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11 (ZH11)的OsIAA11序列进行编辑,获得OsIAA11突变植株,通过对突变植株的农艺性状指标开展田间调查分析,以期探索OsIAA11突变对水稻...     

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得高直链淀粉水稻种质

【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术遗传改良水稻种质,创制高直链淀粉新材料。【方法】以水稻品种中花11为试验材料,利用CRISPR/Cas9编辑系统对水稻淀粉分支酶（Starch branching enzymes, SBE）基因OsSBE3进行靶向编辑,利用PCR技术鉴定无标记纯合突变体,并测定其淀粉含量。【结果】T0代获得10株突变体株系,T1代获得5个无标记纯合突变株系,其中4个株系（sbe3-22-6、sbe3-25-3、sbe3-25-4、sbe3-25-6）的直链淀粉含量和淀粉直支比显著高于野生型。【结论】本研究创制了高直链淀粉含量的水稻新种质,为水稻品质改良提供了参考。     

通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑SSSⅡb基因改良稻米品质

[目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料.[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种'宁粳4号'淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定,选出目标育种材料.[结果]对...     

基于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的水稻定向改良研究进展

水稻（Oryza sativa L.）是单子叶植物研究的模式作物,同时也是世界上最重要的粮食作物之一。我国是世界上最大的稻米生产国和消费国,水稻在保障粮食安全方面发挥着极其重要的作用。水稻品种的不断改良升级是保障稻米稳产增产的有效途径。以育种家经验为基础的传统育种方式的育种周期长、精准性差、可预见性低,已逐渐不能满足现代育种需求。CRISPR/Cas9 是继锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）等技术之后的新一代基因编辑技术,能在不改变受体遗传背景的前提下,精准、定向地改造控制重要性状的功能基因以达到性状快速升级改良的目的,已逐步成为动植物科学研究和作物育种的重要工具。目前CRISPR/Cas9 基因编辑技术已经广泛应用于水稻重要性状的定向改良和种质资源创新研究。综述了 CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理及其在水稻抗病性、品质、育性、非生物胁迫等方面的研究进展,并对 CRISPR/Cas9技术的发展和未来在水稻育种中的应用进行了展望,为未来 CRISPR/Cas9 基因编辑技术在作物定向改良中的进一步利用提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是近年发现的继ZFNs和TALENs两种基因编辑技术之后的一种新型基因组定点编辑技术。本研究分别从CRISPR/Cas9系统的结构、类别、作用机制、相关应用以及存在问题等方面进行综述,旨在为相关领域研究提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在真菌中的应用

CRISPR/Cas系统是一种新型基因编辑技术,因为它制作成本低廉、操作过程简单、快捷且易于掌握的特点,迅速地在动物、植物和微生物等多种生物中成功实现了基因组定点修饰。简述了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的结构、作用机理,对CRISPR/Cas9在真菌基因组编辑中的应用进展进行了概述,并对该技术存在的问题及应用前景进行了展望。     

利用CRISPR/Cas9技术创制糯稻种质

基因组编辑技术已成为分子育种的重要手段。本研究利用CRISPR/Cas9系统,以直链淀粉含量合成基因Waxy(Wx)为编辑对象,构建敲除载体,利用农杆菌介导法转化优质粳稻品种圣稻22,共获得了20个T₀代转化株系,测序结果表明16个株系实现了对Wx基因的定点编辑,突变率为80%,纯合及双等位率为20%。稻米外观品质检测表明13个株系外观呈现糯稻表型,直链淀粉含量测定表明有3个株系的直链淀粉含量降至2.0%以下。可见,利用CRISPR/Cas9系统可以快速改良水稻品种的直链淀粉含量目标性状,在品种的定向改良方面具有巨大的潜力。     

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定向降低水稻落粒性

【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段--CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-gRNA、U6a-qSH1T1-gRNA表达盒,最后将2个gRNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T₀代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T₀代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T₀代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T₁代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T₁代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T₂代qsh1纯合突变系群体（17SZ01和17SZ02）。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。     

基因编辑CRISPR/Cas9技术在农业领域的应用

CRISPR/Cas9系统通过靶向突变对植物基因组进行编辑,是研究基因功能和作物改良的第三代基因编辑工具。本文介绍了CRISPR/Cas9打靶系统基本结构、工作原理,并展示了其在作物基因功能研究和品质改良中的应用前景。     

CRISPR/Cas9技术编辑新疆甜瓜全缘叶基因

【目的】以新疆甜瓜地方品种老汉瓜为研究材料,对其全缘叶基因进行基因编辑,构建新疆甜瓜CRISPR/Cas9敲除载体,分析甜瓜耐受潮霉素最大浓度,为研究新疆甜瓜裂叶基因的功能奠定基础。【方法】在课题组前期确定甜瓜全缘叶基因PLL的基础上,结合甜瓜基因组数据,设计PLL基因外显子的特异靶位点,构建甜瓜全缘叶基因PLL的CRISPR/Cas9敲除载体,将构建好的载体转化到大肠杆菌中,并测序验证,然后对甜瓜耐受潮霉素浓度进行分析。【结果】针对全缘叶基因PLL外显子选择一个长约20 bp的靶位点,根据靶位点设计sgRNA框,并成功将其构建到CRISPR/Cas9敲除载体上,然后将载体成功转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜可耐受潮霉素的最大浓度为10 mg/L。【结论】成功获得甜瓜全缘叶基因PLL的敲除载体,并转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜耐受潮霉素的最大浓度,为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究新疆甜瓜裂叶基因pll的功能奠定基础。     

丝瓜LcPPO1基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

[目的]通过CRISPR/Cas9系统构建丝瓜LcPPO1基因编辑载体.[方法]根据前期已经克隆得到的LcPPO1基因序列,设计2个sgRNA靶位点序列,退火制备sgRNA双链,分别与线性PCA1301-Cas9载体连接获得2个重组载体,将重组载体转化DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析.[结果]2个sgRNA靶位点序列已经分别准确地连入PCA1301-Cas9载体,插入序列无突变.[结论]成功构建了丝瓜LcPPO1基因编辑载体PCA1301-Cas9-sgRNA1和PCA1301-Cas9-sgRNA2,为后续研究丝瓜LcPPO1基因功能奠定了基础.     

利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

[目的]随着人们生活水平的不断提高,具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎.水稻的香味性状主要受第8染色体上的BADH2基因控制,该基因突变造成稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉的积累而产生香味,加速香稻培育的进程.[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以适宜江西种植的粳稻台南11为研究材料,在BADH2基因...