同步检测动物源性成分的四重PCR的条件优化和检出限分析

为建立肉制品中牛、羊、猪、鸡动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用4对牛、羊、猪和鸡源特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组)对多重PCR反应条件进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明:四重PCR方法最佳反应条件为牛、羊、猪、鸡源特异性引物浓度分别为0.16μmol∕L、0.40μmol∕L、0.16μmol∕L、0.16μmol∕L,退火温度58℃,退火时间45 s,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪和鸡4种动物源性成分四重PCR的g DNA检出限为25 pg。应用优化后的四重PCR方法对20份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达45%。本试验为该4种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。     

食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法

【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA,通过比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法;基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别;应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法;在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

不同肠球菌基因组DNA提取方法对PCR鉴定的影响

为研究肠球菌基因组DNA的不同提取方法对16SrRNA基因序列PCR、种属多重PCR、RAPDPCR等肠球菌鉴定结果的影响,分别采用6种基因组DNA提取方法(水煮法1、水煮法2、常规酚/氯仿抽提法、chelex-100法1、chelex-100法2和试剂盒法),对1株肠球菌标准菌株ATCC29212基因组DNA进行提取,以这些分别提取的DNA为模板在相同的扩增条件下进行PCR检测.结果表明,在16SrRNA基因序列PCR和种属多重PCR检测中以水煮法1进行肠球菌DNA的提取最适宜,而试剂盒法在RAPDPCR检测中效果最佳.     

AIV、NDV和安卡拉病毒多重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立鉴别禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和安卡拉病毒(FAV-4)的多重PCR检测方法。【方法】根据GenBank已登录的AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4的Hexon基因序列,设计合成了3对特异性引物。提取3种病毒DNA/RNA,通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。应用建立的多重PCR方法对67份临床病料进行检测,并将其结果与已建立的单重PCR检测结果进行比较。【结果】成功建立了能快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,该方法特异性良好,对传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡痘病毒(FPV)、鸡马立克病病毒(MDV)的扩增结果均为阴性;敏感性较强,能检测出的NDV、FAV-4和AIV最低核酸质量浓度分别为24.3,30.4和28.0pg/μL。多重PCR方法临床病料的检测结果与单重PCR检测结果一致。【结论】建立的AIV、NDV和FAV-4多重PCR检测方法方法可以用于临床上3种病原的鉴别诊断。     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

一种快速鉴定羚牛组织的技术研究

羚牛(Budorcas taxicolor)是国家一级重点保护动物,被世界自然保护联盟(International Union for Conservation of Nature, IUCN)列为易危物种,但其被盗猎的行为时有发生。为了在打击盗猎时能够提供快速准确的鉴定证据,基于实时荧光定量PCR技术,通过筛选特异的荧光定量PCR引物,以期准确区分羚牛与鸡、牛、羊、猪等家禽家畜的组织样品。结果表明,引物tk-p3和tk-p5在羚牛肌肉组织中的表达水平显著高于鸡、牛、羊、猪,表明其可以在mRNA水平有效区分羚牛与家禽家畜的肌肉组织。但鉴于组织中mRNA容易降解的特性,进一步在基因组DNA水平进行定量检测,结果表明,引物tk-p3和tk-p5同样在羚牛中的表达水平显著高于鸡、牛、羊、猪。因此,筛选到的两对特异性荧光定量PCR引物tk-p3和tk-p5可用于快速准确地鉴定羚牛组织,为打击羚牛盗猎行为提供有效的技术支撑。     

多重PCR鉴定水牛胚胎性别的研究

【目的】建立多重PCR鉴定水牛胚胎性别的技术体系,为下一步优化多重巢式PCR方法奠定基础。【方法】采用热裂解法、蛋白酶K+二硫苏糖醇（DTT）法和吐温-20+DTT法分别提取水牛卵裂球DNA,比较3种方法对G3PDH基因的扩增效果;同时设计1对检测引物和1对内标引物用于胚胎性别鉴定,提取胚胎DNA后进行多重PCR检测。【结果】吐温-20+DTT法具有良好的裂解效果,其有效检出率为97.1%;而经吐温-20+DTT法抽提的DNA用于多重PCR检测,其胚胎鉴定率达到100.0%。【结论】采用吐温-20+DTT法处理水牛胚胎样品后再进行多重PCR性别鉴定可以简化操作步骤、提高鉴定效率,但样品数量不宜太少。     

多重PCR鉴定水牛胚胎性别的研究

【目的】建立多重PCR鉴定水牛胚胎性别的技术体系,为下一步优化多重巢式PCR方法奠定基础。【方法】采用热裂解法、蛋白酶K＋二硫苏糖醇（DTT）法和吐温-20＋DTT法分别提取水牛卵裂球DNA,比较3种方法对G3PDH基因的扩增效果;同时设计1对检测引物和1对内标引物用于胚胎性别鉴定,提取胚胎DNA后进行多重PCR检测。【结果】吐温-20＋DTT法具有良好的裂解效果,其有效检出率为97.1%;而经吐温-20＋DTT法抽提的DNA用于多重PCR检测,其胚胎鉴定率达到100.0%。【结论】采用吐温-20＋DTT法处理水牛胚胎样品后再进行多重PCR性别鉴定可以简化操作步骤、提高鉴定效率,但样品数量不宜太少。     

PCR检测饲料中牛源组织成分的研究

为从动物饲料中快速检测所含牛源组织成分以有效防止疯牛病传入，根据牛线粒体基因核苷酸序列设计1对引物，应用CheleX法分离饲料中牛源组织成分的DNA．对分离的DNA进行PCR扩增、基因克隆及核苷酸序列分析，并建立饲料中牛源组织成分的PCR检测方法．用建立的PCR方法对羊、猪、鸡、兔和鱼组织基因组DNA进行扩增，均无特异条带；将牛组织基因组DNA倍比稀释，分别对各个稀释度的DNA进行PCR扩增，结果表明，该方法对牛组织DNA检测的敏感度可达25．2pg／μL．用该研究建立的方法对含不同量牛肉粉的鱼粉进行检测，其最小检测量达0．05％（质量分数），整个过程约需3h．     

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

 【目的】建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法。【方法】根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪、鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp。【结果】通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%。【结论】建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一。     

AS-PCR在牛羊异种核移植上的应用

利用PCR反应延伸过程中,3′端碱基不配对,PCR反应不能启动的等位基因特异性PCR分析法(AS-PCR)原理,采用生物软件DNASTAR分析牛、羊线粒体细胞色素b(Cytb)基因,以牛、羊碱基差异较大位点作为上游引物的3′端来设计引物,进行PCR扩增反应,分析牛羊异种克隆胚中线粒体的变化情况。结果表明,AS-PCR法是一种快速、有效鉴定异种重构胚中线粒体异质性的方法。     

单头赤眼蜂DNA提取方法比较及其PCR反应体系优化

为了探明有效的基因组DNA提取方法和PCR反应体系,从而得到符合分子生物学实验要求的基因组DNA模板的数量和质量,以单头松毛虫赤眼蜂为材料,应用CTAB法、SDS法和Chelex法进行基因组DNA提取效果的比较,并将核酸助沉剂用于赤眼蜂DNA的提取中,然后将提取的基因组DNA采用L16(45)正交设计试验,对影响赤眼蜂基因组DNA PCR反应体系的5因素(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、DNA模板、Taq聚合酶)4水平进行筛选。结果表明:CTAB法优于SDS法和Chelex法,且核酸助沉剂的加入明显增强了模板DNA提取效果。同时确立的ITS2的PCR优化反应体系为:总体积为25mL,Mg2+浓度为1.50mM,dNTPs浓度为0.25mM,引物浓度为0.30μM,DNA模板取2.00μL,Taq聚合酶量为2.00U。     

PCR技术诊断隐孢子虫病方法的建立及其初步应用

本研究应用聚合酶链反应(PCR)建立了一种检测人及牛粪便中隐孢子虫卵囊 DNA 的方法.以蔗糖梯度离心法纯化鼠源 C.muris 卵囊;甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化牛源 C.muris、牛源 C.parvum 和鼠源C.parvum 卵囊.结果发现甘油漂浮-G_3耐酸漏斗过滤法纯化隐孢子虫卵囊具有纯度高、回收率达96%、介质便宜及操作简便等优点.纯化卵囊经液氮冻融后按常规法提取 DNA 作为 PCR 模板.根据 GenBank 中C.muris 和 C.parvum 18SrRNA 基因序列,应用计算机辅助设计合成一对 PCR 引物(上游引物:5′-AAACCCAACTTTGCGGAAGG-3′,下游引物:5′-CCATGCTGGAGTATTCAAGGC-3′).以此引物扩增     

特异性单引物对猪肉中细菌的鉴别

本研究为了建立一种新的猪肉细菌快速鉴别法,使用特异性引物Tian Primer,应用荧光定量PCR法对从猪肉中分离出的7种未知细菌进行了分析,并和16S rRNA的PCR分析(是细菌的系统分类研究中最常用的分子种,约1.5 kb左右)进行了比较。结果表明,该新特异性单引物PCR法从7种细菌提取的基因组DNA中都得到了各不相同的多重PCR产物,比传统的16S rRNA的PCR分析得到的PCR产物(1465 bp)要丰富的多。因此,这一新特异性单引物PCR法具有比传统的16S rRNA的PCR分析法更精确的细菌鉴别潜力。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

4种不同土壤微生物DNA提取方法对DGGE分析微生物群落的影响

分别应用高盐法、玻璃珠破碎法、冻融法和试剂盒法4种不同土壤微生物DNA提取方法提取水稻稻田土壤微生物DNA,并通过细菌16SrRNA V3区通用引物GC338f-530R和真菌18SrRNA特异性引物NS1-GCFung进行PCR扩增结合变性梯度凝胶电泳(CGGE)分析,对4种DNA提取方法进行评价。结果表明,玻璃珠破碎法和试剂盒法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求;其中试剂盒方法操作简单,提取的DNA质量较高,但DNA产量较低且成本昂贵;玻璃珠破碎法用时较长,步骤繁琐,DNA产量较高,纯度较低,但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响,且成本低廉。     

家禽血液基因组DNA的快速提取

[目的]建立一种应用硅胶膜提取禽血DNA的新方法。[方法]应用硅胶膜法和传统的酚/氯仿法提取抗凝禽血基因组DNA,设计合成了一对2.7 kb的鸡卵清蛋白基因的引物,检测这2种方法提取的基因组DNA模板对聚合酶链式反应（PCR）扩增效率的影响。[结果]用硅胶膜法提取的基因组DNA产量和质量均比传统的酚/氯仿法高,将该法提取的基因组DNA作为模板能够消除抗凝剂对后续PCR反应的影响。[结论]硅胶膜法为快速提取高质量的禽血基因组DNA奠定了基础。     

末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化

末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)是以荧光标记引物PCR为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。本文综述了该方法在群体微生物分析上的应用及DNA提取、PCR扩增、酶切和数据分析等步骤的技巧与优化,总结了科学应用该技术的要求以及和多重PCR、gyrB基因等相结合的观点。     

羊角槭基因组DNA提取及SRAP-PCR体系优化

采用CTAB法、SDS法、偏重亚硫酸钠法提取槭属中羊角槭基因组DNA,通过DNA含量测定、琼脂糖凝胶电泳检测对所提DNA质量进行分析.结果表明, 3种提取方法中CTAB法最适合提取羊角槭基因组DNA,所得DNA的质量和纯度较高.以CTAB法提取的DNA为模板进行SRAP扩增反应,对SRAP反应体系的dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度3个主要影响因子进行筛选.获得羊角槭SRAP最优反应体系为:50 μl的PCR体系中含有DNA模板100 ng、10×PCR Buffer (不含Mg2+)、Mg2+ 2.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.5 μmol/L、Taq DNA聚合酶 1.0 U.