正交设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以辣椒基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP反应体系中的5种关键因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行优化,结果表明,辣椒SRAP-PCR最佳反应体系为:Taq DNA 聚合酶0.75 U、Mg2+ 0.6 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.8 μmol/L、模板DNA 50 ng,总体积为10 μL.运用该体系对辣椒3份种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从198个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的35个引物组合.该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒分子遗传学中的应用提供科学依据.     

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持.[方法]采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证.[结果]最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00ng,dNTPs 0.25mmol/L,Mg2+1.50mmol/L,引物0.80μmol/L,TaqDNA聚合酶0.50U.利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物.使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性.[结论]建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究.     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

西北地区大蒜及其野生蒜SSR-PCR体系优化及引物筛选

为探索了解西北地区大蒜及其野生蒜资源之间的亲缘关系及变异特性,以25份西北地区及野生大蒜鳞茎和叶片为材料提取模板DNA,筛选适于简单重复序列(SSR)-PCR的反应体系。采用L₁₆(4³)正交表设计正交试验并进行单因素试验,对影响大蒜SSR-PCR的相关体系参数进行优化。结果表明,适用于大蒜的SSR反应体系总体积为10μL:模板DNA 30.0 ng,正反引物均为0.5μmol/L,2×Taq PCR Mix 5.0μL,其余用dd H₂O补齐。扩增程序：94℃预变性3 min; 94℃变性30 s,不同引物最佳退火温度退火45 s, 72℃延伸90 s; 30次循环的最后1次循环72℃延伸设为10 min, 4℃保存扩增产物。最终在上述PCR条件下从50对SSR通用引物中筛选出13对多态性好、稳定性高的适用于大蒜SSR-PCR多样性分析的候选引物。     

线辣椒SSR-PCR反应体系优化及多态性标记筛选

以循化线辣椒果实黄色突变体H0809和高代自交系0599-1为试材,采用L_9(3~4)正交试验设计,研究线辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并对420对SSR分子标记进行筛选。结果表明,最优的反应体系为:总体积20μL,基因组DNA 20 ng,dNTP 100μmol·L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)2.5 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1.5μmol;通过筛选,获得72对具有多态性的SSR标记,多态性率为17.1%,平均每个标记扩增出2.67个等位基因。本试验建立的SSR-PCR反应体系和筛选的多态性标记可用于线辣椒种质资源分析、分子标记辅助育种、分子遗传图谱构建及基因克隆等研究。     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

蜡梅AFLP反应体系优化及引物筛选

通过对影响AFLP反应体系主要因素的优化,建立了蜡梅的AFLP反应体系,并筛选出了适宜该体系分析的引物.结果表明,20μL蜡梅AFLP最佳酶切体系为模板600 ng DNA,3 U Pst I和3 U Mse I,在37℃下双酶切2 h;在20μL最佳连接体系中酶切产物为15μL,3 U T4连接酶,0.25μmol.L-1 Pst I接头,2.5μmol.L-1 Mse I接头,1μL 10×T4 Buffer,在22℃下连接10 h;在20μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5μL,2.0mmol.L-1 Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC);在20μL最佳选择性扩增反应体系中5μL稀释20倍的预扩增产物,2.0 mmol.L-1的Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1 dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC).最后,利用上面的体系筛选出了96对适宜于蜡梅AFLP分析的引物.     

白芨属SRAP引物筛选及反应体系优化

为给白芨种质遗传多样性评价、分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础,建立适于白芨SRAP-PCR扩增的反应体系,利用L16(45)正交试验设计对白芨SRAP-PCR反应体系中的各影响因子进行探索.结果表明:Mg2+浓度为影响白芨SRAP-PCR反应的关键因素;在优化的20μLSRAP-PCR反应体系中各组分的最适含量为10×Buffer 2.0 μL,Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.2μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 2.0 ng/μL.利用SRAP反应体系,从72对SRAP引物组合中筛选出条带清晰、扩增稳定、多态性好的引物15对.     

悬铃木AFLP反应体系优化及引物筛选

以三球悬铃木为试验材料,通过对影响AFLP反应体系的各主要因素的研究,建立了悬铃木AFLP分析技术的体系.结果表明,悬铃木AFLP最佳酶切体系(20 μL)为模板DNA 1 000 ng,PstⅠ和MseⅠ各为3U,在37℃下双酶切3h;在20 μL最佳连接体系中,15 μL酶切产物为3U,T4连接酶,0.25 μmo...     

木薯SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化木薯SCoT-PCR反应体系并进行SCoT引物筛选,为木薯辅助育种提供技术支持。【方法】以木薯品种新选048为材料,利用正交试验设计对DNA模板量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶量等因素进行优化,确定木薯最佳SCoT-PCR反应体系,并用其进行SCoT引物筛选。【结果】木薯最佳SCoT-PCR反应体系(20.0μL):模板DNA 60 ng,引物浓度0.30μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U,Mg2+1.50 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L。利用该体系筛选出19条SCoT引物,能稳定扩增出数量多、清晰可辨且多态性丰富的条带。【结论】优化的木薯SCoT-PCR反应体系检测结果稳定,重复性好,且筛选出的19条引物均适用于木薯遗传多样性分析。     

观赏海棠SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

以观赏海棠叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2＋、dNTP、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶5种因素4个水平,对观赏海棠的SRAP反应体系进行了研究,建立了观赏海棠的SRAP最佳反应体系,结果表明,观赏海棠SRAP-PCR最佳反应体系为：Mg^2＋ 2.50mmol·L^-1、dNTP0.2mmol·L^-1、引物0.4μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶2U、10ng模板DNA,总体积为25μL。各因素对扩增反应结果均有不同影响,其中以dNTP浓度的影响最大,模板浓度的影响最小。运用该体系对观赏海棠4个种进行验证,证明该体系稳定可靠,并从70个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的26个引物组合。这一体系的建立及多态性引物组合的筛选为今后利用SRAP标记技术进行观赏海棠的分子遗传学研究提供了科学的依据。     

泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选

以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物.     

禺毛茛SRAP反应体系优化及引物筛选

以禺毛茛叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以10×Buffer、Mg2+、dNTP和引物4种因素3个水平,对禺毛茛SRAP反应体系进行研究,并比较了不同浓度模板DNA、Taq酶用量对扩增效果的影响,建立了禺毛茛的SRAP最佳反应体系.结果表明,禺毛茛SRAP-PCR最佳反应体系为:20 μl反应体系中,10×Buffer 2.5 μl,25 mmol/L Mg2+ 2.5 μl,2 mmol/L dNTPs 1.5 μl,5 μmol/L引物1.0 μl,模板量为100～200 ng,Taq酶0.5 U.运用该体系对10份禺毛茛进行验证,证明该体系稳定可靠,并从100个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的36个引物组合.这一优化的体系及多态性引物组合为利用SRAP标记技术进行毛茛属植物分子遗传学研究提供了科学依据.     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

悬铃木SSR反应体系建立及引物筛选

以三球悬铃木组培苗为试验材料,对影响SSR-PCR扩增效果的退火温度、dNTP、引物浓度、Taq酶量及悬铃木DNA等因素的筛选,建立适宜的悬铃木SSR-PCR分子标记反应体系。结果表明,在20μL-1体积中,50℃退火温度、4 ng.μL-1模板DNA、0.2 mmol.L-1 dNTP、0.05 U.μL-1 Taq酶量和0.6μmol.L-1引物浓度是悬铃木的最适SSR反应体系。此外,利用该体系筛选出了54对适合悬铃木SSR扩增的引物。     

藜麦SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

藜麦原产南美洲,因其全营养性被誉为"超级谷物"而广受重视,国内对藜麦的研究也逐步开展。本文通过研究SSR-PCR反应体系的五个主要成分对扩增结果的影响,建立了藜麦SSR-PCR反应的优化体系,即总体积10μL:DNA模板75ng, 10×PCR buffer(Mg~(2+)plus)1.2μmol/L、dNTP 0.8μmol/L、Taq酶0.2μmol/L,引物1.2μmol/L,余下部分由dd H_2O补足。利用优化后的SSR-PCR反应体系对引物进行筛选,从221对引物中成功筛选出条带清晰、特异性好的引物18对。优化后的SSR反应体系和筛选出的引物可为藜麦种质资源的遗传多样性研究、指纹图谱的建立等提供科学依据。     

蜡梅SSR反应体系建立及引物筛选

以素心蜡梅为材料,分别通过对影响蜡梅SSR扩增效果的模板DNA,dNTP,引物浓度,Taq酶和退火温度等因素的筛选,建立了其适宜的蜡梅SSR分子标记反应体系,同时筛选了适宜蜡梅SSR扩增引物.结果表明,蜡梅SSR扩增的适宜退火温度为55 ℃,在20μL反应体系中,蜡梅模板DNA质量浓度、dNTP引物浓度分别为5mg·L...     

松毛虫AFLP反应体系的建立及引物筛选

为研究不同环境条件下松毛虫的遗传多样性,以油松毛虫为材料研究松毛虫的AFLP反应体系。对选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析。结果显示,在选择性扩增体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg2+浓度1.5 mmol/L、dNTP浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.500pmol/L,Taq酶用量为1U,扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到稳定的结果。用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合。     

正交设计优化芒果SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以芒果基因组DNA为模板,采用正交试验对模板DNA含量、引物浓度、2×Taq PCR Master Mix含量进行3因素5水平正交试验优化。结果表明,相关序列扩增多态性PCR(sequence related amplified polymorphism,SRAPPCR)最佳反应体系为:30 ng模板DNA、0.3μmol/L引物、10μL 2×Taq PCR Master Mix,总体积为25μL。运用该体系对10份芒果种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从100对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的36对引物组合。     

RSAP标记技术新引物设计及其反应体系的优化

【目的】对限制性位点扩增多态性(Restriction site amplified polymorphism,RSAP)标记技术进行改进,并优化了其反应体系。【方法】遵循引物设计原则,使限制性位点序列位于中间,在其3′端增加3个选择性碱基,5′端设计为10~12个碱基的随机序列,设计了14条长为19 bp的限制性位点扩增多态性(RSAP)新引物。以大白菜、紫菜薹自交系及其F1、F2的DNA为模板,对新引物的反应体系进行了优化,并对其重复性和适用性进行了检验。【结果】新设计引物PCR扩增的前5个循环退火温度为35℃,后35个循环为52℃;在25μL优化反应体系中,模板DNA用量为2.0μL(20.0 ng/μL)、Mg2+3.0μL(25 mmol/L)、Taq酶(5 U/μL)1.5 U、dNTPs 2.0μL(2.5 mmol/L)、引物各0.6μL(10μmol/L);新引物扩增出的谱带较原引物更多,多态性更好;只改变选择性碱基,新设计引物就能扩增出新的谱带;新设计引物的重复性、稳定性好,在荞麦和小麦品系,以及紫菜薹、大白菜及其F1、F2中,新引物均能扩增出清晰谱带。【结论】新引物适用性和重复性好,可广泛应用于其他作物的基因组DNA分析。