白背飞虱VAMP7和Vti1a蛋白的原核表达、抗体制备及应用

白背飞虱Sogatella furcifera的囊泡相关膜蛋白7(VAMP7)和囊泡转运蛋白(Vti1a)隶属于SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)家族,该家族蛋白主要参与生物体中关键的膜转运过程。前期研究发现这两种蛋白分别与南方水稻黑条矮缩病毒Southern rice black-streaked dwarf virus(SRBSDV)的主要外层衣壳蛋白P10存在显著互作,推测可能协助病毒粒体在介体白背飞虱内的转运和扩散。为了进一步利用血清学技术研究VAMP7和Vti1a在传毒过程中的功能,本研究克隆了白背飞虱编码这两种蛋白的基因,成功构建了VAMP7和Vti1a基因的原核表达载体,并将载体分别转入大肠杆菌中进行诱导表达,得到了相应的原核表达蛋白。在蛋白纯化后,将纯化蛋白注射于新西兰大白兔体内进行免疫,分别制备得到VAMP7和Vti1a的抗体。两种抗体经Western blot检测发现,均可分别与白背飞虱体内的VAMP7和Vti1a特异性结合。利用制备的抗体对白背飞虱的肠道进行免疫标记,激光共聚焦显微镜观察发现所制备抗体能够在白背飞虱中肠上皮细胞的胞质中特异性标记到VAMP7和Vti1a,表明制备的抗体能够成功用于这两种蛋白的体内外检测,为阐明这两种蛋白参与传播SRBSDV的机制研究奠定了基础。     

灰飞虱体内水稻条纹病毒的检测

为评价灰飞虱体内水稻条纹病毒检测方法的适用范围,利用已经制备的水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的多克隆抗体SV21和单克隆抗体3B9,采用多孔板间接ELISA、DIBA和Western blotting等三种方法进行单头灰飞虱Laodelphax striatellus Fallén(SBPH)体内RSV检测。结果表明,检测灵敏度以多孔板间接ELISA最高,其次为DIBA,Western blotting最低;用单克隆抗体3B9检测灵敏度高于多克隆抗体SV21。RT-PCR、IC-RT-PCR和DB-RT-PCR三种方法中,RT-PCR对单头灰飞虱稀释到400倍可检测到病毒;IC-RT-PCR在多克隆抗体SV21稀释浓度大于500倍时检测不出RSV,单克隆抗体3B9稀释浓度大于800倍时检测不到RSV;DB-RT-PCR检测结果显示,单头灰飞虱在稀释400倍后均无阳性反应。     

烟芽夜蛾囊泡病毒3h株3h-122基因于棉铃虫幼虫体内的转录表达分析

本文构建了烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(HvAV-3h)第122个基因(3h-122)的原核表达载体并制备多克隆抗体?利用蛋白免疫印迹?RT-PCR?免疫组织化学染色等技术检测3h-122的转录表达时相以及组织特异性?结果表明, 3h-122编码大小16.1 kD的结构蛋白(3H-122)?HvAV-3h感染棉铃虫幼虫后3 h开始检测到3h-122的转录并稳定持续至第168 h?3H-122在棉铃虫感毒后24 h至168 h可持续检测到其表达?此外, 3H-122主要在脂肪体组织中表达?本研究为阐明囊泡病毒结构蛋白的功能及其在囊泡病毒致病机制中的作用奠定了基础?     

基于酵母双杂交系统筛选灰飞虱体内与大麦黄条点花叶病毒核衣壳蛋白互作的蛋白质

 为了获取影响大麦黄条点花叶病毒(BYSMV)在灰飞虱体内增殖、积累和传播的相关介体因子,本研究利用分离泛素酵母双杂交膜系统,以BYSMV核衣壳蛋白(N)为诱饵对灰飞虱cDNA文库进行了筛选。 将BYSMV N基因构建到诱饵载体pDHB1上进行表达检测和功能验证,结果表明重组载体pDHB1-N能在酵母内正常表达并行使功能。利用诱饵载体筛选pPR3-N空文库对文库筛选条件进行优化,确定3-氨基-1,2,4-三唑(3-AT)浓度为12 mmol·L^-1的QDO平板为筛选文库培养基条件,去除可能存在的轻微筛库背景。在此筛选条件下以诱饵载体从灰飞虱cDNA文库中筛选得到57个阳性克隆,序列比对结果表明这些阳性克隆编码17种候选蛋白,包括表皮蛋白、泛素B、核糖体膜相关蛋白、细胞色素b5以及海藻糖转运蛋白等。 经酵母双杂交共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步确认了这17个候选蛋白与BYSMV N发生互作。本研究成功从灰飞虱分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库筛选到与BYSMV N互作的蛋白质,为进一步探索弹状病毒与介体昆虫的分子互作机制奠定了基础。     

灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

以灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）mRNA为起始模板,利用Gateway技术构建了灰飞虱酵母双杂交cDNA文库。经过检测表明：构建的初级cDNA文库的库容量为1.85×107 cfu;扩增文库滴度为7.7×108 cfu/mL,重组率约为97%;扩增文库插入片段主要集中在1 000~1 500 bp之间。随机挑取10个克隆,经测序与GenBank数据库比对结果显示7个克隆具有同源序列,其中L2、L9为已公布的灰飞虱序列。灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究灰飞虱与其传播的水稻病毒间的互作奠定了基础。     

瓜类褪绿黄化病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 根据已报道的瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus, CCYV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法从感病甜瓜中扩增得到长度为753 bp的CP基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3上,获得重组载体pGexCP,在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了CCYV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,当CP蛋白浓度为2.5 μg/mL时,血清效价高达5.12×10⁵。Western blot分析表明制备的抗体检测CCYV侵染的甜瓜叶片得到特异性的条带,表明该抗体的特异性较好。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甜瓜病样的检测。本试验为CCYV的快速检测提供了重要的研究材料。     

桑脉带相关病毒N蛋白多克隆抗体的制备

 桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的新成员,是广西桑树病毒病的主要病原病毒。本研究将MVBaV核外壳蛋白(nucleocapsid protein, N protein)基因连接到pET-30a原核表达载体上,获得重组表达载体pET-30a-MVBaV-N并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导可表达产生一个含His标签、分子量约36.0 kDa的融合蛋白。用 Ni^{2 +} -NTA树脂纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔制备多克隆抗体。间接ELISA测定抗体的效价为1∶256 000。Western blot 检测结果显示,该多克隆抗体在稀释倍数1∶1 000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,但不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。将抗体按1∶2 500稀释后进行间接ELISA,可有效检出桑叶中的MVBaV。MVBaV N蛋白抗体的成功研制,为桑脉带病毒病的诊断及MVBaV与寄主相互作用机制的研究提供了重要的试剂。     

水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程

 水稻黑条矮缩病毒 (Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) 由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以持久增殖型方式传播, 其编码的P9 1蛋白是形成病毒复制和子代病毒粒体装配的场所—病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确RBSDV在介体昆虫体内的侵染循回过程, 本研究通过原核表达的P9 1蛋白免疫注射兔子制备P9 1抗体, 应用免疫荧光标记技术研究P9 1在饲毒后不同时期的介体灰飞虱体内的定位。共聚焦显微镜观察到饲毒后3 d, P9 1出现在介体中肠的少数上皮细胞内;饲毒后6 d, 在中肠外表的肌肉细胞分布有P9 1;饲毒后10 d, P9 1分布于中肠和后肠表面的肌肉, 同时在唾液腺也能观察到P9 1的存在。结果表明RBSDV在介体灰飞虱体内首先侵染中肠上皮细胞并复制, 随后扩散到中肠表面的肌肉细胞, 并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后肠, 最后扩散到唾液腺。本研究首次直观地阐述了RBSDV在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程, 为有效阻断灰飞虱携带并传播病毒奠定基础。     

中国小麦花叶病毒(CWMV)复制酶基因在病株体内的表达分析

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起我国小麦花叶病的重要病原之一,其基因组由2条单链正义RNA片段(RNA1-2)组成。本研究根据发表的基因组序列设计特异性引物,扩增了CWMV复制酶基因的部分片段(nt102~1101),并克隆至原核表达载体pGEX-6P1,然后导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达。重组的复制酶蛋白经亲和层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。Western-blot分析表明该抗体具有高度的特异性,能用于病株体内CWMV复制酶蛋白的检测。检测分析显示在病株体内,CWMV基因组RNA1可直接充当其复制酶基因的mRNA;在感染的细胞中,其复制酶组分主要是RNA1 ORF1编码的蛋白,分子量约153 kDa,且特异性地定位于膜结构上。     

应用RT-PCR和dot-ELISA方法检测单头灰飞虱体内水稻条纹病毒

本文比较了RT-PCR和dot-ELISA两种方法对单头灰飞虱携带水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的检出率、检测灵敏度和检测成本。结果表明,两种方法均能检测到单头灰飞虱体内的RSV,RT-PCR检测单头灰飞虱体内RSV的阳性检出率比dot-ELISA方法低11.79%~15.77%,但RT-PCR的检测灵敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技术的检测成本比dot-ELISA的高。结果暗示,对于单头介体昆虫中的病毒检测,RT-PCR技术的检出率不一定比dot-ELISA的高。综合考虑后,如对室外大批量灰飞虱进行带毒率检测时可采用dot-ELISA方法,如需准确分析单头灰飞虱体内RSV时可采用RT-PCR方法。     

泡桐丛枝植原体抗原膜蛋白抗血清的制备及应用

 根据报道的泡桐丛枝植原体(Paulownia witches’-broom phytoplasma,PaWB)抗原膜蛋白(antigenic membrane pro-tein,AMP)基因的核苷酸序列设计引物,提取发病泡桐总DNA,经PCR扩增并成功克隆泡桐丛枝植原体amp基因。序列分析表明,amp基因由696个核苷酸组成,编码231个氨基酸残基,与GenBank中登录的2个泡桐丛枝植原体的膜蛋白核苷酸序列同源性为100%。将amp基因91-604 nt部分序列(命名为ampd)克隆到原核表达载体pGEX-4T-3,诱导后,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表明融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以纯化的带GST标签的AMPD融合蛋白为抗原免疫德国大白兔,制备了PaWB-AMPD抗血清。利用该血清,通过Western印迹、点印迹、ELISA、间接免疫荧光和免疫捕获PCR试验均能在发病泡桐组织中特异检测到泡桐丛枝植原体。     

水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗体制备

为探讨水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）的种群变异,采用RT-PCR方法从感染RBSDV山东分离物RBSDV-JN1的水稻中克隆该病毒的S10片段,并进行序列分析,进而构建包含RBSDV-JN1的CP基因的原核表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达;并以表达的融合蛋白为抗原,制备病毒的多克隆抗体。结果显示：S10片段全长为1 801 bp,包含1个1 677 bp编码框,编码558个氨基酸的外壳蛋白（CP）;与GenBank已注册的19个RBSDV的CP基因序列相比较发现,病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为90.5%~99.8%,氨基酸的序列相似性为95.9%~100.0%;地理位置较近的分离物间序列相似性较高,RBSDV种群分布呈现区域性差异。原核表达载体pET-RBSDV-CP经IPTG诱导,获得了分子量约为63 kD带有His标签的目的蛋白。用该蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、Western blot和Dot-blot ELISA检测显示,效价为1：81 000,且具有良好的特异性。     

小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗体制备及应用

 小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起的小麦矮缩病是近年来我国小麦生产中的一种重要病毒病害,急需研发快速精准的检测技术用于预测预报和病毒-介体相互作用的研究。本研究应用Gateway重组技术构建了外壳蛋白基因(Coat protein, CP)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导获得CP基因原核表达蛋白。以重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备得到了相应的抗体,Western blot检测表明制备的抗体能与CP重组蛋白、感病小麦和带毒叶蝉特异性结合,说明获得的抗体特异性高。用获得的抗体进行免疫荧光标记,观察到病毒分布在介体叶蝉的前中肠和中中肠部位,为WDV的预测预报和介体条沙叶蝉传毒机制的研究奠定了基础。     

大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白抗血清制备及其与同属BYDVs的血清学关系

 大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses, BYDVs)属于黄症病毒科,主要以蚜虫为介体进行传播,引发多种作物减产或绝收。本文将BYDV-PAV青海分离物的运动蛋白(MP)克隆到原核表达载体pDB-MBP-His上,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下表达蛋白分子量约为61 kDa的融合蛋白。将纯化后的蛋白作为抗原免疫‘新西兰’大白兔制备抗血清,Western blot检测本生烟瞬时表达带标签的MP蛋白,结果显示该抗血清效价为1∶32 000,灵敏度达1∶256,且该抗血清可与相差34个氨基酸的PAV015株系以及隶属于黄症病毒属其他的BYDVs(PAS、MAV、KerⅡ和KerⅢ)MP均能发生强烈的血清学反应,具有血清学相关性。本研究制备的大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白多克隆抗体为探索BYDV-PAV运动蛋白的功能以及作用机制打下了基础。     

利用桥梁载体策略构建水稻条斑病菌T3SS基因诱导表达检测体系

 水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS)。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)将效应蛋白注入水稻细胞中,激发寄主水稻的感(抗)病性。为了准确在Xoc中进行T3SS基因表达调控的分析,本研究设计出桥梁载体策略,将目标基因的启动子或者功能片段构建在高拷贝的桥梁载体,获得融合表达元件,通过亚克隆的方式将融合元件转入骨架载体上,获得用于转录表达和蛋白表达分析的载体。为了验证该策略的可行性,选取hrpG、hrpX和hrcC基因构建了相应的启动子探针载体和蛋白表达载体,将这些载体导入毒性调控子基因trh、lrpX和zur的突变体中,GUS活性测定、荧光定量PCR以及蛋白免疫杂交结果显示:在trh、lrpX和zur的突变体中,hrpG、hrpX和hrcC的转录表达水平、mRNA水平和蛋白表达水平呈现一致。这表明这套桥梁载体策略能够有效应用于T3SS基因转录表达和蛋白表达的分析。综上所述,运用桥梁载体能够克服低拷贝载体DNA遗传操作效率低的缺陷,这一策略也适用于毒性相关基因调控机理的研究,这将为Xoc-水稻互作研究提供高效的工作系统。     

水稻条纹病毒对介体灰飞虱生长发育相关基因转录水平的影响

由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起的水稻条纹叶枯病是我国粳稻产区的一种毁灭性病毒病害。RSV主要由半翅目昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久增殖型方式传播,与无毒灰飞虱相比,带毒灰飞虱五龄和整个若虫阶段的发育历期缩短,最终羽化的成虫数减少。为了从分子上揭示RSV对灰飞虱生长发育的影响,本文研究了RSV对灰飞虱生长发育相关基因转录水平的影响。将灰飞虱转录组拼接后建立本地数据库,根据黑腹果蝇生长发育基因序列比对出10种灰飞虱同源基因序列,设计特异引物,通过RT-q PCR方法分别对带毒和无毒灰飞虱体内这10种基因的转录水平进行检测。结果显示,在RSV的影响下,8种基因的转录发生显著变化,其中2种蛋白质转录被激活,6种蛋白质受到抑制。动力蛋白和钠钾转移ATP酶转录水平的变化可能影响灰飞虱神经系统发育,造成昆虫行为异常;桩蛋白转录下降会影响翅的发育;与细胞骨架相关的5种蛋白质转录也受到了RSV抑制,可能影响灰飞虱羽化过程。对生长发育基因转录水平的初步探究为更好地理解RSV与灰飞虱的互作奠定了基础。