大血藤RAPD 条件的优化

在进行大血藤遗传多样分析时, 首先要建立大血藤RAPD 反应优化体系, 有必要就反应条件进行探索。以改进SDS 法抽提藤本药用植物大血藤叶片总DNA , 进行随机扩增多态DNA (RAPD)分析, 分别测试了镁离子、dNTP 、模板DNA 含量、引物浓度、DNA 聚合酶量和牛血清白蛋白浓度对反应结果的影响。通过各因子的组合研究, 得出大血藤RAPD 分析较适宜的扩增条件是:15 L PCR 反应体积, 1 Taq 酶配套缓冲液(10 mmolL-1 TrisHCl pH 9.0 , 50 mmolL-1 KCl , 0.1 %Triton X-100 , 1.5 mmolL-1 MgCl2);25.01 10-9mols-1 Taq 酶(上海华美公司);10 ng 模板DNA ;15 pmol 引物(上海Sangon 公司);2 gL-1 BSA ;dATP ,dCTP ,dGTP 和dTTP 各0.15 mmolL-1 。图4 表2 参8     

华东黄杉ISSR引物反应体系的优化与筛选

在研究华东黄杉(Pseudotsuga gaussenii Flous)的遗传多样性过程中,为了获得清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的多个因素包括模板浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、Taq酶的用量、退火温度和循环次数等指标进行了筛选和优化,确定了华东黄杉ISSR-PCR分析的最佳扩增条件为:20μL PCR反应体系中,2μL10×Taq酶配套缓冲液,1.5 UTaq聚合酶(上海Promega公司),1.5~2.5 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs,10 ng/L模板DNA。用来自江西三清山的4个个体,以100个ISSR引物进行PCR扩增,筛选出扩增效果较好的12个引物。     

濒危植物七子花ISSR反应体系的优化

以濒危植物七子花基因组DNA为研究对象,测试了ISSR-PCR反应体系的最适退火温度,并利用单因素试验测试了镁离子浓度,dNTP浓度,模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物用量、甘油浓度对反应结果的影响,可知七子花ISSR分析较适宜的扩增条件是:10μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol.L-1Tris.HC l pH 9.0,50 mmol.L-1KC l,0.1%Triton X-100),2.0 mmol.L-1MgC l2,0.75 U Taq酶(上海华美公司),10 ng模板DNA,6 pmol引物(上海Sangon公司);dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2 mmol.L-1.     

毛白杨ISSR反应体系的建立及优化

为应用ISSR技术开展毛白杨遗传变异分析、辅助育种、品种鉴定、系统进化等研究,以(GTG)6为引物,通过单因子实验分别研究了退火温度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量对毛白杨ISSR-PCR反应的影响,建立并优化了适宜于毛白杨ISSR分析的扩增体系: 20 μL PCR反应体系,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 0.1% Trion X100, pH 9.0),1.5 mmol/L MgCl2,1.0 U Taq酶,10 ng模板DNA,0.2 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTP. 引物(GTG)6的最适退火温度为61℃.      

基因工程实验教学中PCR反应条件的正交优化

采用碱裂解法提取大肠杆菌的质粒DNA,检测提取到的DNA浓度和纯度,并以提取的DNA作为PCR反应体系中的模板,采用搜索性正交设计试验法探求PCR反应体系中4个因素(dNTPs、DNA模板、引物和Taq酶)在5个水平上的最适用量,在此基础上,进一步设计细调性正交试验筛选PCR反应的最适条件。结果表明,在20μl PCR反应体系中,DNA模板5 ng/μl,dNTPs 0.25 mmol/L,引物0.6μmol/L,Taq酶1.5 U/μl,Mg2+浓度1.5 mmol/L时,PCR的效果最好。     

珍稀濒危植物香果树ISSR-PCR反应体系的筛选与优化

以珍稀濒危植物香果树(Emmenopterys henryi)基因组DNA为研究对象,测试了ISSR-PCR反应体系的最适退火温度,并通过对反应体系中的Mg2 、dNTP浓度、模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物浓度的筛选和优化,获得了香果树ISSR分析较适宜的扩增条件是:10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol·L-1 Tris·HCl pH9.0,50 mmol·L-1 KCl,0.1%Triton X-100),2.0 mmol·L-1 MgCl2,0.75 U Taq酶,10 ng模板DNA,12 pmol引物;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.2 mmol·L-1,2 mg·mL-1牛血清白蛋白.香果树的合适退火温度为48.5℃.     

毁灭炭疽菌RAPD和ISSR-PCR最佳反应体系的建立

对影响PCR反应的主要因子-Md2+、dNTP、Taq酶、引物浓度进行优化,建立起适合于毁灭炭疽菌基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系.RAPD反应体系(25μL):Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Taq酶用量为1U,引物浓度1μmol/L.ISSR反应体系(25μL)为:Mg2+浓度为2 mmol/L,dNTP浓度为150μmol/L,Taq酶用量为0.5 U,引物浓度为1.25 μmol/L.     

均匀设计法优化人类SMN基因PCR扩增

采用均匀设计法,对影响PCR的主要因素,即退火温度、引物、Taq酶、二甲基亚砜(DMSO)、模板DNA进行了优化,得到人类SMN基因的最优PCR扩增体系。结果表明,PCR扩增条件和反应体系的最优组合为:退火温度61.6℃、Taq酶0.26μL、引物(10μmol/L)3.6μL、DMSO(100%)2μL、DNA 3.8μL。     

蚕豆RAPD反应体系的建立与优化

利用正交设计L16(45)对蚕豆RAPD-PCR反应的5因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、模板DNA、引物)在4个水平上进行优化试验,结果表明蚕豆最佳的RAPD-PCR的反应体系(20μl)为:10×缓冲液2.0μl,1.0 U Taq DNA 聚合酶、1.5 mmol/L Mg2+、0.4mmol/L dNTPs、3 mmol/L引物、200 ng 模板 DNA.     

中药艾总DNA的提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为探索艾的遗传多样性,采用正交试验方法 L16(45)与单因素分析法相结合对其PCR反应的5个主要因素(Mg2+、引物、模板DNA、dNTPs以及Taq酶)在4个水平上分别进行优化。结果表明:得到最佳的反应体系(20μL)为模板DNA 60ng,Mg2+2.5mmol/L,引物0.8μmol/L,dNTPs 0.15mmol/L,Taq酶1.0U。通过统计数据分析,对艾ISSR-PCR反应的影响程度依次为Mg2+浓度引物模板DNAdNTPs浓度Taq酶。     

青花菜RAPD扩增条件的优化

以青花菜(Brassica oleracea var italica)基因组DNA为材料,对RAPD(随机扩增多态技术)扩增反应的各种影响因子进行了优化和筛选,建立了适宜的RAPD扩增条件.即10μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),1.5 mmol/L MgCl2,1U Taq酶,16 ng模板DNA,16 pmol引物,dNTP 0.15 mmol/L,3 mg/mL BSA.青花菜RAPD反应体系的建立为青花菜种质资源鉴定和利用提供了可靠的技术支持.     

华山松SRAP-PCR反应体系的优化

为建立华山松SRAP-PCR反应体系,研究先采用L16(45)正交设计对影响华山松SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验。结果表明:各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+>dNTPs>Taq酶>DNA模板>引物;对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度)进行单因素试验;确立华山松SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.2mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、DNA模板60ng、Taq酶0.8mol/s、引物0.8μmol/L。将该体系用于华山松的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

珍稀濒危竹种筇竹(Qiongzhuea tumidinoda)RAPD反应条件的优化

以宜宾筇竹为材料建立了筇竹RAPD反应优化体系,用于筇竹遗传多样性分析,以改进的CTAB法提取筇竹叶片总DNA,分别测试了镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度、模板DNA含量、DNA聚合酶量对反应结果的影响。通过对各因子的组合比较,建立了筇竹RAPD反应优化体系:20μL PCR反应体积,10×Taq酶配套缓冲液(2μL);1.25 U Taq酶;75 ng模板DNA;45 ng引物;1.88 mmol/L MgCl2;0.19 mmol/L dNTP。     

大血藤ISSR-PCR反应体系的建立

采用改进的SDS法抽提大血藤基因组DNA,分析了镁离子、dNTP、模板DNA含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶量和BSA浓度对大血藤ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了稳定的、可重复的大血藤ISSR最佳反应体系:10μL PCR反应体积中,4×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HC l,pH9.0,50 mmol/L KC l,1 g/LTriton X-100),0.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgC l2,0.1 mmol/L dNTP,12 pmol引物,10 ng模板DNA,2 mg/mL牛血清白蛋白。大血藤的最适退火温度为52.4℃。     

伊贝母植物ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用CTAB法提取叶片DNA,通过单因素试验,研究了Taq DNA聚合酶用量、dNTP、引物和Mg(2+)浓度4种因素对伊贝母ISsR-PCR扩增的影响.结果表明,适于伊贝母ISSR-PCR的反应体系为25μL总体积中含1 x PCR反应缓冲液(无Mg(2+)1.0 U Taq DNA聚合酶、0.6 mmol/L dNTPs、0.4μmol/L引物、1.5 mmol/L MgCl2.     

麻疯树SRAP-PCR反应体系的优化

采用L9(45)正交设计对影响麻疯树SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验,PCR结果采用SPSS13.0进行分析。结果表明,各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+dNTPs引物Taq酶DNA模板。对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度)进行单因素试验,确立麻疯树SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.5 mmol/L、引物0.4μmol/L、dNTPs150μmol/L、DNA模板60 ng、Taq酶0.5 U。将该体系用于麻疯树的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

牛血清白蛋白对连香树PCR反应体系的优化

[目的]为了取得更好的PCR扩增效果,建立高效的PCR反应体系。[方法]首先通过6因素5水平的正交试验对连香树RAPD-PCR反应体系优化组合,然后不再改变该结果中的其他条件,而仅改变Taq酶的浓度及在反应体系中加入不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）。[结果]在25组Taq酶和BSA浓度组合中,BSA改善连香树RAPD-PCR反应的最佳浓度为0.6μg/μl,Taq酶浓度可由1.0μg/μl减少至0.4μg/μl。最后优化得到的20.0μl连香树RAPD反应体系为：25mmol/LMg2＋2.0μl,dNTPs0.4μl,1U的TaqDNA酶1.0μl,10×Buffer缓冲液2.5μl,0.5OD引物0.8μl,约25ng模板0.6μl。[结论]BSA的适当加入减少了Taq酶的用量,在保证更好的试验效果前提下,节约了试验成本。     

瓠瓜ISSR—PCR反应体系优化

利用正交设计L9(34),对瓠瓜ISSR-PCR反应体系的4因素(dNTP、引物、Mg2 、Taq酶)在3水平上进行优化试验,建立适合瓠瓜ISSR-PCR反应体系,结果表明,在25μL反应体系中,含1×PCR buffer、200μmol·L-1dNTP、0.5μmol·L-1引物、2.5mmol·L-1 MgCl2、30ng模板DNA、0.75U的Taq酶为最佳处理;通过PCR梯度测验,瓠瓜ISSR扩增适宜的退火温度比Tm值高2~6℃。     

基于荧光检测的糜子Genic-SSR PCR体系优化

[目的]本研究基于Fragment Analyzer全自动毛细管电泳荧光检测系统,以期建立一个最优的糜子GenicSSR分子标记PCR反应体系。[方法]试验采用L16(44)正交设计,设计了Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的不同浓度组合,并用Pragment Analyzer全自动毛细管电泳荧光检测系统检测PCR产物。[结果]Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物浓度对PCR反应效应为:Mg2+引物dNTPsTaq DNA聚合酶。通过正交实验设计确立了糜子Genic-SSR荧光PCR检测体系的最佳反应组分:20μL的反应体系中包含0.2 mmol·L-1的dNTPs,0.2μmol·L-1引物,1.5mmol·L-1的Mg2+和0.5U的Taq DNA聚合酶。[结论]本研究建立了糜子的Genic-SSR分子标记的最佳荧光PCR反应体系,为糜子种质资源遗传多样性分析中分子标记开发、验证和辅助育种奠定了基础。     

骆驼刺ISSR-PCR反应体系的建立

用CTAB法提取叶片DNA,然后通过单因素实验,研究了Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素对ISSR-PCR扩增的影响,建立了适合于骆驼刺的ISSR-PCR反应体系,其为25μL总体积中含1×PCR反应缓冲液(无Mg2+)、1.5U Taq DNA聚合酶、0.6 mmol/L dNTPs、0.6μmol/L引物、1.5 mmol/L MgCl2。