融合基因Ghrelin/GHRH真核表达质粒的构建及其促生长效应

根据文献报道的猪Ghrelin与生长激素促释放激素(GHRH)基因序列,设计了含Ghrelin信号肽及Ghrelin与GHRH部分核苷酸序列及lin-ker序列等共233 bp的基因序列,通过基因合成的方法获得基因片段,并将其连入克隆载体pUC57中,经双酶切将其克隆至PCI真核表达载体中。经PCR、酶切和测序鉴定,证明融合猪Ghrelin和GHRH基因的真核表达载体pCI-Ghrelin/GHRH构建成功;提取PCI-Ghrelin/GHRH质粒并体内转染小鼠腿部肌肉组织,观察25 d内pCI-Ghrelin/GHRH质粒对小鼠体重的影响,结果表明:0~10 d试验组小鼠平均日增重高于pCI-Ghrelin-28aa组及生理盐水组,但试验组后期增重缓慢。     

PCI-Ghrelin-28aa质粒微球对小鼠的促生长效应

以乳酸-乙醇酸共聚物为载体，采用复乳-液中蒸发法制备PCI-Ghrelin-28aa真核表达质粒微球，微球大小与文献报道相符，平均粒径分布在2~3 μm间，测得的包封率为99.27%，载药量6.8 μg/mg，回收率65.7%；将质粒微球肌肉注射小鼠，并记录25 d里小鼠的体重变化情况；体重统计结果表明，25 d时微球包裹质粒组累积增重比裸质粒组、生理盐水组分别高14.3%、27.9%(P<0.05)。结论认为，载PCI Ghrelin 28aa质粒微球具有缓释作用，并有增强质粒吸收及表达的趋势。     

PPVVP2基因与PCV2ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性

为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPVVP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPVSC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、c（A：117～131aa,B：157～183aa,C：165～200aa）和PPVVP2基因。将A、B、C基因分别与PPVVP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPVVP2蛋白和PCV20RF2抗原表位的重组质粒pCI—A—VP2、pCI13-Vp2、pCI—C—VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4＋／CD8＋细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI—13-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。     

PPV VP2基因与PCV2 ORF2不同抗原表位重组真核表达载体的构建及其免疫原性

为了研究PCV2ORF2的不同抗原表位重组PPV VP2基因真核表达质粒的体外表达情况与免疫原性,分别以PCV2SC株和PPV SC-1株为模板,扩增PCV2ORF2的抗原表位基因A、B、C(A:117～131aa,B:157～183aa,C:165～200aa)和PPV VP2基因。将A、B、C基因分别与PPV VP2基因串联,并插入到pCI真核表达载体中,构建了能同时表达PPV VP2蛋白和PCV2ORF2抗原表位的重组质粒pCI-A-VP2、pCI-B-VP2、pCI-C-VP2。将重组真核表达质粒转染MDBK细胞,用间接免疫荧光试验检测各个质粒在细胞中的表达情况;并将其免疫小鼠,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法检测免疫效果。结果显示,3种重组表达质粒转染细胞48h后都能检测到较强的免疫荧光;免疫小鼠后14～42d诱导的T淋巴细胞转化效率、CD4+/CD8+细胞比值以及PPV和PCV2抗体均显著高于对照组,且pCI-B-VP2免疫效率高于其他组。该结果表明PCV2ORF2上157～183aa抗原表位在3个抗原表位中抗原性最强,可作为PCV2与其他病毒二联疫苗研究的主要抗原表位。     

小鹅瘟病毒VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果

检测小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因真核表达质粒在小鼠中的免疫效果。大量提取本实验室已构建的含有GPVVP3基因的真核表达质粒pVAXI／VP3和空载体pVAXI,分两组进行两点肌肉注射免疫小鼠,共免疫4次。利用MTY法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,间接ELISA法检测免疫小鼠血清中GPV特异性抗体的水平。淋巴细胞增殖指数,免疫小鼠与正常小鼠差异不显著。间接ELISA检测结果表明,pVAXI／VP3质粒免疫组小鼠血清中GPV特异性抗体水平,显著高于空载体对照组和阴性对照组。已构建的GPVVP3基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫,为小鹅瘟核酸疫苗的研究奠定基础。     

梅山猪LH-β基因真核表达系统的构建及体内外转染表达效果的研究

将克隆的梅山猪LH-β基因亚克隆到真核表达型载体VR1020上，通过质粒PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用BamH I、BglⅡ双酶切鉴定重组子。得到的重组真核表达质粒转染Cos7细胞株，RT—PCR检测猪LH—β表达情况。然后用VPLH—β质粒、VR1020分别肌肉注射小鼠，研究了小鼠的生殖特性情况。结果显示：通过质粒PCR和双酶切分析，得到猪LH—p基因以正确方向插入的重组真核表达质粒VPLH—β。重组质粒VPLH—β经脂质体介导转染Cos7细胞，培养不同时间后提取mRNA进行RT—PCR，发现转染细胞RNA中含有与LH—β基因对应的mRNA；结果表明已成功构建了PLH—β的真核表达质粒，能正确转录表达LH—β。动物试验结果显示PLH—β免疫小鼠后的各项指标均高于对照处理。克隆构建的猪VPLH—β质粒能发挥明显的生殖生理调节作用，可较好地促进雌性动物的排卵、怀孕和正常产仔。     

气肿疽梭菌CctA基因真核表达载体的构建与鉴定

为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。     

纹皮蝇HypoderminC基因真核表达质粒构建及小鼠免疫试验

根据GenBank发表的Hypodermin C(HC)基因序列设计引物,以原核表达载体pET-HC为模板,PCR扩增HC基因,将克隆基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-HC。将重组质粒pVAX1-HC转染小鼠胎儿成纤维细胞,以间接免疫荧光法检测HC基因在细胞中表达。用真核表达质粒pVAX1-HC经双侧胫前肌注射昆明小鼠,对小鼠进行体液免疫和细胞免疫研究。结果表明,小鼠血清抗体水平和淋巴细胞增殖水平明显高于非免疫对照组。本研究成功构建了真核表达质粒pVAX1-HC,为纹皮蝇核酸疫苗研发奠定了基础。     

山羊流产嗜衣原体OmpA基因重组质粒构建及对小鼠免疫效果研究

为探讨山羊流产嗜衣原体重组真核质粒进入临床试验的可行性,本试验用PCR方法扩增出山羊流产嗜衣原体OmpA基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）中,经PCR和双酶切鉴定后,将重组质粒pcDNA3.1-OmpA转染至PK-15细胞,观察目的基因表达情况,并将制备的大肠杆菌基因组单链DNA作为分子佐剂与重组质粒共同免疫小鼠,检测重组质粒在小鼠体内分布情况及血清抗体水平。结果表明,经PCR、双酶切和测序鉴定表明成功构建重组质粒pcDNA3.1-OmpA;转染PK-15细胞后,荧光抗体试验结果证实重组质粒pcDNA3.1-OmpA得到有效表达。首免后14 d,重组质粒加分子佐剂组的抗体效价显著高于重组质粒组和灭活疫苗组（P<0.05）;随着免疫次数增加和时间推移,免疫小鼠抗体水平均呈现上升趋势,至35 d时达到最高峰,此后抗体滴度逐渐下降,但仍维持较高水平。首免后21 d,在小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、脑、空肠和腿肌中均可检测到质粒的分布,此后逐渐消失,49 d在所检组织中均未检测到重组质粒的存在。表明试验成功构建了基于OmpA基因的山羊流产嗜衣原体重组真核质粒,且加入分子佐剂后可诱导小鼠产生较高水平的血清抗体。     

犬新孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒的真核共表达及免疫学评价

为对犬孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒进行免疫学评价,本实验以含有MAG1-IFN-γ基因片段的克隆质粒为模板,扩增MAG1-IFN-γ目的片段,构建pVAX-MAG1-IFN-γ重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达,并免疫BALB/c小鼠,进行免疫学评价。结果表明,PCR扩增获得基因片段大小为1 536 bp,与GenBank中登录的MAG1和IFN-γ核苷酸序列的同源性为99%;IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈现特异性绿色荧光;western blot分析表达蛋白的分子量为57 ku,具有较好的反应原性。将构建的重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。本实验为新孢子虫病核酸疫苗的深入研究奠定了基础。     

RFRP-3对大鼠采食行为和生长性能的影响

为了探讨RFRP-3对大鼠采食行为以及生长性能的影响,选取体重相近的清洁级SD大鼠30只,随机分为3组,分别为对照组[腹腔注射生理盐水200 μL/(次·只)]、RFRP-3低剂量组[腹腔注射1 μg/100 μL RFRP-3,200 μL/(次·只)]和高剂量组[腹腔注射10 μg/100 μL RFRP-3,200 μL/(次·只)],每组10只,雌、雄各半,每天注射2次,连续腹腔注射14 d。观察和记录大鼠的采食量、采食行为和体重变化,计算料肉比及Lee指数,分离血清并检测血脂相关指标,并对下丘脑食欲相关因子的表达水平进行检测。结果表明,与对照组相比,仅在光照环境中腹腔注射高剂量RFRP-3会导致大鼠采食量极显著(P<0.01)增加;采食行为方面主要表现为采食频率极显著(P<0.01)增高和饱腹率明显下降;生长性能方面主要表现为体重增长极显著(P<0.01)加快以及料肉比显著(P<0.05)降低;在肥胖指标中,Lee指数显著(P<0.05)增加,血清中甘油三酯和总胆固醇的含量极显著(P<0.01)升高;下丘脑NPY mRNA表达水平显著(P<0.05)上升,而POMC mRNA表达水平显著(P<0.05)下降。试验表明,腹腔注射RFRP-3可促进大鼠的采食行为并提高其生长性能,且这种生理功能的发挥可能是通过调节下丘脑食欲相关因子的变化完成的。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

小鼠髓过氧化物酶(MPO)基因克隆分析及真核表达载体的构建

髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一种血红素辅基蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一,参与多种疾病的发生和发展过程.本研究旨在克隆小鼠MPO基因CDS全长序列,检测该基因在小鼠神经细胞的表达谱.首先利用RT-PCR法与克隆载体克隆小鼠MPO基因CDS全长序列,对其进行生物信息学分析;然后构建真...     

NDPKB真核表达载体的构建及其对细胞生长活性的影响

将目的基因NDPKB连接到pEGFP—N1真核表达载体，转染Vero细胞，通过增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和Westernblotting分析，鉴定构建的pEGFP—NDPKB真核表达载体的正确性；利用生物信息学工具分析预测NDPKB蛋白的三维结构和可能存在的活性位点；MTT试验检测NDPKB对细胞生长活性的影响。结果显示，pEGFP-NDPKB真核表达载体构建成功，在Vero细胞中NDPKB和GFP蛋白能有效地融合表达。在线预测了NDPKB蛋白的三维结构和可能存在的活性位点。MTT试验结果表明，NDPKB对Vero细胞生长活性的抑制率为25．8％，对A549细胞生长活性的抑制率为22．7％。结果表明，NDPKB能够抑制细胞的生长，对细胞的凋亡具有正调节作用。     

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。     

移植骨髓间充质干细胞对乳腺炎模型大鼠血清中酶及抗体水平的影响

试验旨在研究乳房基底部移植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对乳腺炎大鼠血清中髓过氧化物酶(plup peroxidase,MPO)、乳过氧化氢酶(milk catalase,LP)及免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)的影响。从70只SD正常雌性大鼠中随机选取5只,于产后72 h,即试验-1 d屠宰,作为正常对照,同时其余65只参照国内常用建立乳头管灌注内毒素的方法,从大鼠乳房基底部注入0.05 mL(50 μg)内毒素。乳腺炎模型建立成功1 d后,即试验0 d,随机选5只屠宰作为对照,同时将其余60只随机分为3组,即对照组(乳房基底部注射生理盐水50 μL)、抗生素组(乳房基底部注射抗生素50 μL(5000 U/侧))和移植BMSCs组(乳房基底部移植BMSCs 50 μL(1×10⁶个)),每组20只,于试验1、3、5和7 d各组分别屠宰5只,所有屠宰大鼠从心脏处采血制备血清,送检血清中MPO、LP、IgM、IgA和IgG含量。结果表明,治疗后各时间点移植BMSCs组血清中MPO含量均显著低于对照组(P<0.05),1和7 d时LP含量显著低于对照组(P<0.05)。1和5 d时移植BMSCs组IgA、IgG和IgM含量均显著高于对照组(P<0.05),7 d时IgG和IgM含量显著高于对照组(P<0.05),1和7 d时IgG含量、3和5 d时IgA含量及5 d时IgM含量均与抗生素组差异显著(P<0.05)。因此,BMSCs和抗生素都能降低乳腺炎大鼠血清中MPO和LP含量,提高IgM、IgA和IgG含量,且移植BMSCs组对抗体的总体作用效果比抗生素组显著。     

猪生长激素促分泌素受体基因真核表达载体的构建及鉴定简

本试验旨在构建猪生长激素促分泌素受体（pGHS-R）真核表达系统,并瞬时转染人源胚胎肾细胞（HEK293T）观察其表达情况。以猪基因组为模板,通过剪接重叠延伸聚合酶链式反应（SOE-PCR）克隆出pGHS-R的编码区序列,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/pGHS-R,酶切鉴定并测序,加myc标签,瞬时转染HEK293T细胞,用Western blotting鉴定该重组质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的蛋白。结果显示,本试验成功扩增出pGHS-R编码序列,酶切和测序结果表明pcDNA3.1(+)-myc/pGHS-R构建正确,Western blotting方法证实转染的该质粒能在HEK293T细胞中正确表达目的蛋白。结果表明,本试验成功构建了pGHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础。     

Increased postnatal growth rates of offspring after antiestrogen treatment of rat dams during pregnancy.

The effects of administration of estradiol antiserum to pregnant rats on birth weight, subsequent growth velocity, carcass composition, and reproductive performance of their offspring were examined. Treated rats were injected i.p. with a potent antiestradiol serum on d 12 of gestation, whereas control rats received a similar injection of normal sheep serum. The pups from the treated rats were 12.2% heavier at birth than those from control rats (P less than .01) and had a greater postnatal growth rate (P less than .05). Chemical analysis of body composition at 56 d of age revealed that there was a tendency for female offspring from treated rats to exhibit carcass characteristics (such as increased percentage of body fat) that were more similar to those of normal male rats than to those of normal female rats. Neither onset of puberty nor reproductive performance was affected by the treatment. These results indicate that treatment of rats during pregnancy with antiestradiol may have potential as a technique for increasing postnatal growth rates.     

辽宁绒山羊DLX3毛囊表达载体的构建及其转染成纤维细胞的研究

根据GenBank中已发表的DLX3基因(登录号:XM_005694267.1)序列设计引物,以辽宁绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,采用RT-PCR方法,扩增出DLX3基因的CDS区,连接平末端载体并验证后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接。真核表达载体经Xho Ⅰ和BamHⅠ双酶切鉴定后,通过脂质体法转染绒山羊耳源成纤维细胞,在荧光显微镜下观察细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,并通过RT-PCR和Western blotting技术检测目的基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆了绒山羊DLX3基因,并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-DLX3。重组质粒转染绒山羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增909 bp的转录产物,并利用Western blotting检测到32.87 ku目的蛋白DLX3的表达。本试验结果为研究DLX3基因在绒山羊毛囊生长周期内的功能以及调控毛囊生长发育的机制奠定了基础。