蜻蜓凤梨AfAP2-1基因的克隆与表达载体构建

通过对蜻蜓凤梨转录组数据的分析,我们获得一个跟拟南芥AP2同源片段,基于此设计引物,利用RACE技术首次从蜻蜓凤梨中克隆到完整的Af AP2-1序列,其c DNA全长2 185 bp,开放阅读框全长1 404 bp,编码467个氨基酸。保守结构域分析其含有两个AP2结构域,属于AP2亚家族。系统进化树分析发现该蛋白与拟南芥的AP2 RAP2.7亲缘关系较近。通过在CDS序列两端分别引入XbaⅠ和KpnⅠ限制性内切酶酶切位点,我们成功构建了Ca MV35S-Af AP2-1-GUS过表达载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥植株后,再通过GUS染色和RNA水平鉴定发现Ca MV35S-Af AP2-1-GUS已转入拟南芥中并且能正常表达。本研究可为Af AP2-1的功能鉴定奠定基础,对深入研究凤梨科植物开花调控的分子机理具有重要意义。     

新西兰白兔γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定

用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定,结果显示重组IFN-γ在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-γELISA试剂盒测得重组兔IFN-γ的浓度为1 950 pg/mL。细胞病变抑制法结果显示,重组兔IFN-γ在MDCK上显示了较高的抗病毒活性,并测得重组兔IFN-γ的活性约为5.12×105 U/mg。     

TUNEL法检测类猪圆环病毒2型因子P1诱导猪免疫器官细胞凋亡的研究

研究类猪圆环病毒2型因子P1体内诱导的细胞凋亡作用。将P1分子克隆接种普通仔猪,用原位末端标记技术(TUNEL)检测猪的扁桃体、脾脏、腹股沟淋巴结等免疫器官细胞的凋亡情况。猪感染P1后21和35 d的扁桃体、脾脏和腹股沟淋巴结等免疫器官细胞出现了凋亡。P1可能引起猪的免疫抑制。     

NPR1和Cry1Ab13-1基因双价植物表达载体的构建及在玉米中的转化

单一的抗病、抗虫品种已经不能满足需求,因此,本研究通过基因工程技术构建同时具有抗病基因 NPR1 基因和抗虫基因 Cry1Ab13-1 基因并以 bar 基因为筛选标记的植物双价表达载体并进行遗传转化,以获得优良的特点同时兼具抗病抗虫的新株系。通过农杆菌介导法、花粉管通道法和超声波介导法将构建好的植物表达载体在玉米中进行遗传转化,并对 T₂代转基因植株进行 PCR 检测、Southernblotting 整合度检测、实时荧光定量 PCR 转录水平检测、室外抗虫以及室内抗病初步鉴定。结果表明：共获得 T₂代 PCR 阳性植株 14 株。Southern Blot 结果表明,NPR1 和 Cry1Ab13-1 双价基因已经分别以单拷贝形式整合到玉米受体中。实时荧光定量 PCR 结果表明 NPR1 和 Cry1Ab13-1 双价基因在不同组织间相对表达量均高于阴性对照,NPR1 基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为 3.302、1.45、9.75;Cry1Ab13-1 基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为 3.15、1.61、9.89。室外接虫...     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

水稻OsBAK1P基因过表达与RNAi载体构建及其表型鉴定

为了探究水稻油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1前体物质OsBAK1P对水稻相关农艺性状的影响。通过以中花11粳稻品种为材料,根据基因所设计的特异性引物从水稻穗部cDNA中扩增得到CDS片段大小为651 bp的目的序列片段;通过酶切酶连的方法成功构建了PTCK303-OsBAK1P过表达载体和PTCK303-OsBAK1P RNA干扰载体;用农杆菌EHA105菌株转化表达正确的载体质粒并利用基因CDS扩增引物检测菌落筛选出阳性农杆菌克隆;再利用农杆菌遗传转化法侵染中花11粳稻品种的愈伤组织从而获得转基因植株;最后,相比较于中花11挑选2个表型相似的过表达、RNA干扰的T₁转基因植株测定并分析株高、穗长、叶夹角等农艺性状的变化和萌发初期的根长、胚芽鞘长度的变化以及对芸苔甾内酯(BL)的响应程度。结果表明,OE-OsBAK1P转基因水稻植株株高矮化,穗长变短,叶片夹角下降,种子萌发后根长增长而幼苗长度缩短,叶片对BL的响应不敏感;而RNAi-OsBAK1P转基因水稻植株株高增加,穗长变长,叶片夹角增加,种子萌发后根长缩短而幼苗长度增长,叶片对BL的响应敏感。综上,这些结果...     

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从类产碱假单胞菌YSl(Pseudomonas psuedoalcaligenese YSl)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因：phaCl、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对phaCl基因进行了改造，经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaCl)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaCl和phaC2双基因)。将构建好的嵌合phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2，用冻融法转入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHAl05)并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan)。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株，抗性植株大田生长表型正常，生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR-Southern、Southern检测初步确定有32％烟草稳定整合了phaCl和phaC2。用氯仿一次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA，在产物合成水平确证有25．6％的转基因植株。     

大豆FAD2-1b 基因沉默载体的构建

旨在培育生物安全的转基因大豆。设计引物、采用RT-PCR从高蛋白大豆品种‘黑农35’中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆‘黑农37’中克隆FAD2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆品种中克隆FAD2-1b基因片段,作为正向臂和反向臂。连接这些目的片段,构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为FAD2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,扩增得到的重组质粒经酶切和序列分析鉴定正确,命名为pDT-FAD2I。本研究构建了针对大豆FAD2-1b基因的沉默载体,为进一步获得FAD2-1b基因沉默大豆,培育转基因安全的高品质大豆奠定了基础。     

猪CACNA2D1基因3''''UTR单核苷酸多态性与肉质性状的效应研究

CACNA2D1基因定位在猪的第9号染色体上,其位置与影响肉质性状的QTL重叠,可作为肉质性状的候选基因.采用PCR-SSCP技术,对160头金华×皮特兰资源家系F2猪CACNA2D1基因3'端非翻译区片段进行扩增分型,共产生2种等位基因,3种基因型.通过测序发现,在CACNA2D1基因3'端非翻译区(序列DQ981407)有一单核苷酸替换(C→A).对不同标记基因型与肉质性状的最小二乘分析表明,AA基因型猪大腿肌肉的pH45值、大腿肌肉导电率和肌内脂肪含量的最小二乘均数比BB基因型分别高0.169,0.26和0.021,差异显著(P＜0.05);A等位基因的加性效应分别为0.084 5,0.133 5和0.010 5.     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.     

高羊茅FaChit1启动子的克隆及其与gus基因融合表达载体的构建

本研究以获得的FaChit1基因cDNA序列设计引物,采用染色体步移技术从高羊茅基因组中分离了一段FaChit1基因启动子区域。序列分析结果显示,该启动子长度为935bp,含有保守性元件TATA和CAAT-Box,以及与植物逆境胁迫应答相关的多个顺式作用元件,如W-box、ABRE、MYB及MYC转录因子结合位点等。另外构建了含不同长度FaChit1启动子区域(-935bp、-651bp、-233bp)与gus基因融合植物表达载体,分别命名为pFaChit1P-Ⅰ、pFaChit1P-Ⅱ和pFaChit1P-Ⅲ,为进一步进行该启动子的功能分析奠定基础。     

猪CACNA2D1基因3′UTR单核苷酸多态性与肉质性状的效应研究

CACNA2D1基因定位在猪的第9号染色体上,其位置与影响肉质性状的QTL重叠,可作为肉质性状的候选基因。采用PCR-SSCP技术,对160头金华×皮特兰资源家系F2猪CACNA2D1基因3′端非翻译区片段进行扩增分型,共产生2种等位基因,3种基因型。通过测序发现,在CACNA2D1基因3′端非翻译区(序列DQ981407)有一单核苷酸替换(C→A)。对不同标记基因型与肉质性状的最小二乘分析表明,AA基因型猪大腿肌肉的pH45值、大腿肌肉导电率和肌内脂肪含量的最小二乘均数比BB基因型分别高0.169,0.26和0.021,差异显著(P<0.05);A等位基因的加性效应分别为0.084 5,0.133 5和0.010 5。     

抗病基因PR1在大豆中的遗传转化与多抗材料的培育

单一抗病、抗虫品种在农业生产中已经不能满足需要,本研究通过基因工程技术构建抗病基因pCAMBIA-3301-PR1表达载体,通过花粉管通道法转化外源抗病基因PR1到含有CryAB-13-1转基因高世代受体大豆中,得到兼具抗病抗虫新材料。对T2转基因植株进行常规PCR检测,Southern Blot杂交,Real Time PCR检测,室内、室外抗虫鉴定,室内抗病鉴定。结果表明,在T2代常规PCR检测中,阳性植株共15株。Southern Blot杂交结果显示,PR1与CryAB-13-1基因均以单拷贝子的形式整合在大豆中。Real Time PCR表明PR1和CryAB-13-1基因在不同组织中表达量有差异,PR1基因在植物根、茎、叶中表达量平均分别为2.88、1.48、5.86,CryAB-13-1基因在根、茎、叶中表达量平均分别为3.03、1.32、7.11。室外抗虫鉴定阳性植株CryAB-13-1基因的植株虫食率为3.47%,抗虫级别上属于R-抗,抗虫级别从感虫到抗虫级别。室内采用圆盘分隔法进行抗虫鉴定,转化植株芽长有明显增长。室内抗病鉴定未转化植株平均死亡率高达58.34%,转...     

猪白细胞介素-2基因的克隆及其重组禽痘病毒载体的构建

采用RT-PCR技术自豫南黑猪脾淋巴细胞中扩增猪IL-2基因(pIL-2),RT-PCR产物进行T-A克隆并测序,获得了猪IL-2基因序列.将BamH Ⅰ酶切的猪IL-2基因非定向克隆到BamH Ⅰ酶切并去磷酸化的pSY538载体上,通过PCR、酶切和测序鉴定,筛选正向插入的重组质粒pSY538/pIL-2.NotⅠ酶...     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

转cry1C*及cry2A*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性

早粳稻空育131为受体, 以根瘤农杆菌介导遗传转化法创制了转ubi启动子调控下的cry1C*及cry2A*基因早粳稻空育131 (cry1C*)和空育131(cry2A*)。为了研究转基因水稻Bt蛋白的时空表达特性及抗螟虫性, 将不同转化事件形成的转基因早粳稻品系种植于田间, 利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测转基因水稻不同生长发育阶段不同器官的、以及成熟期糙米的Bt蛋白量, 采用室内离体茎秆法接虫鉴定转基因水稻的抗螟虫性。结果显示, 转基因早粳稻不同抗虫基因Bt蛋白量不同, cry1C*基因总是低于cry2A*基因的蛋白质表达量; 不同生长发育时期Bt蛋白量不同, 叶片和茎鞘等器官的Bt蛋白量为分蘖期<抽穗期<灌浆期, 幼穗或糙米等器官的Bt蛋白量为抽穗期幼穗>灌浆期幼穗>成熟期糙米; 不同器官Bt蛋白量不同, 高低次序在分蘖期为叶片、茎鞘, 抽穗期为叶片、幼穗和茎鞘, 灌浆及成熟期为叶片、茎鞘、幼穗和糙米; 同一抗虫基因不同转基因品系间抽穗期叶片、茎鞘和幼穗等器官Bt蛋白量及抗螟虫性、糙米Bt蛋白量等性状存在差异, 抽穗期各器官Bt蛋白量与抗螟虫性及成熟期糙米Bt蛋白量之间相关不显著, 不论Bt蛋白量高或低的品系均表现为高抗螟虫。转基因早粳稻营养器官生长发育前期Bt蛋白量较低、后期较高, 繁殖器官生长发育早期Bt蛋白量较高、晚期较低, 营养器官通常比繁殖器官的Bt蛋白量高。在本研究范围内, 不同基因及不同转化事件培育的转基因水稻Bt蛋白表达量高低不同, 但所有的转基因早粳稻品系均表现高抗螟虫。     

pCDNA3-CT真核表达质粒的构建及其在COS-1细胞中的表达

通过酶切方法自含鸡甲状旁腺素(CT)基因的克隆质粒pGEM-T-CT中扩增CT基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CT在COS-1中的表达。     

河北地区猪圆环病毒二型ORF2基因片段的克隆与原核表达

以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV20RF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌B121(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析.结果表明.重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性.