重大禽病诊断试剂盒在我国研制成功

青岛市科技局邀请有关专家于2004年3月13日在青岛对农业部动物检疫所承担的科技部农业科技成果转化资金项目《8项重大疫病检测、监测及快速准确诊断技术及产品中试》(02EFN213710657)的子课题《禽流感、新城疫和传染性支气管炎RT—PCR诊断试剂盒的研究》和《传     

2014世界肉鸡疫病控制研究和技术发展报告

2014年,危害全球肉鸡业的主要传染病有禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎、禽白血病等病毒性疫病,我国鸡群H5亚型禽流感、新城疫等烈性疾病偶有发生,传染性支气管炎、H9N2亚型禽流感较常见,白血病感染仍然很严重。2014年我国研制出针对7.2分支H5亚型禽流感病毒的Re-7株灭活疫苗并广泛应用;此外,家禽的细菌性疾病依然是一个世界难题,以大肠杆菌、出血性败血症巴氏杆菌、沙门菌、空肠弯曲杆菌等引起的细菌性疫病为主。家禽疫病诊断及检测技术的主要发展趋势是以高通量、快速、高特异性为主要方向,检测方法仍然以RT-PCR技术、单克隆抗体、ELISA、核酸探针技术为主。2014年度我国科研人员已研制多种病毒性及细菌性疫病快速和高通量监测试剂盒,包括检测禽白血病抗原和抗体的ELISA、LAMP、胶体金试纸条等监测试剂盒。目前我国已初步形成禽类疫病监测和诊断体系以及禽免疫抑制病如禽白血病等的净化体系和综合防控措施。     

土杂鸡H9亚型禽流感和传染性喉气管炎混合感染的诊断

为了诊断昆明市某土杂鸡(阉鸡)养殖场疫病类型,采集病鸡喉气管、肺脏、脾脏等组织样品,混合研磨后提取病原核酸,通过RT-PCR对新城疫、禽流感、H5亚型禽流感、H9亚型禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等家禽呼吸系统疫病病原核酸进行检测。检测结果为禽流感、H9亚型禽流感和鸡传染性喉气管炎病原核酸阳性,诊断该病例为H9亚型禽流感和传染性喉气管炎混合感染所致。     

鸡IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立

根据鸡传染性支气管炎病毒M基因、禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,初步建立了针对鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT-PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的3对引物可对同一样品中的IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为333bp(IBV)、438bp(NDV)和196bp(AIV);建立的多重RT-PCR检测方法能够检测出1ng/μLAIV、1ng/μLNDV和10ng/μLIBV的cDNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述3种鸡病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。     

一步法SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

为了建立鸡传染性支气管炎病毒快速、敏感的检测方法,本研究利用RT-PCR技术扩增出鸡传染性支气管炎病毒M基因中134bp的保守序列,并克隆到pMD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了IBV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达3.5×10~1拷贝,与禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床IBV的检测。     

展示我国禽病及禽用疫苗研发实力的国际大舞台

从本次禽病大会交流内容看,各国禽病专家关注及研究的热点依据当地疫病流行及控制状况不同,我国专家主要关注禽流感、新城疫、传染性支气管炎等发病率、死亡率高、危害严重的疫病,国外专家主要关注影响生产性能的禽病和影响家禽产品的微生物安全的感染.扬州大学农业部重点开放实验室刘秀梵院士等共6位专家和2位博士生参会,提交了关于禽流感抗原漂移、毒力基因、新城疫毒株变异、疫苗研究方面的大会报告,其中刘秀梵院士的"在中国H5N1病毒地方流行地区产生不同NA亚型的H5高致病性禽流感病毒"以及胡姣博士、钟蕾博士、胡顺林教授等的口头报告在本次禽病会展示了中国禽流感、新城疫研究的最新成果.     

禽传染性支气管炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速检测禽传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)病原的方法,根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列,设计1对引物,建立了检测IBV的一步法RT-PCR方法,该方法对20份疑似传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)病料、传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)、新城疫病毒(Newcastaldiseasevirus,NDV)进行检测,结果仅IBV为阳性,IBDV、NDV均为阴性。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,最低可检测出约4pg的IBVRNA,将为IBV的病原检测及分子流行病学调查等提供早期快速的诊断方法。     

不对称RT-PCR结合芯片技术鉴别4种禽病的初步研究

本研究结合非对称RT-PCR和基因芯片两种技术,构建可同时区分AIV的H5、H7、H9血凝素亚型和N1、N2神经氨酸酶亚型以及鸡传染性支气管炎病、新城疫病、鸡传染性法氏囊病的基因芯片。分别T／A克隆部分禽流感病毒的M基因,H5、H7、H9亚型HA基因,N1、N2亚型NA基因,鸡传染性支气管炎病毒np基因、新城疫病np基因、鸡传染性法氏囊A基因,并构建重组质粒;以重组质粒为模板,用PCR方法扩增制备探针,纯化后点于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;常规方法从待检样品中提取RNA,用Cy3标记引物进行RT-PCR,将荧光素引入PCR产物中;并对扩增条件进行优化。研究发现检测探针可特异性的与相应的标记样品进行杂交,呈现较强的杂交信号;该方法可以准确进行4种主要禽病的鉴别诊断和禽流感主要流行亚型鉴定,对感染样品和现地样品检测结果与RT．PCR、鸡胚接种有较高一致性,符合率分别为100％和96％。结果显示该方法可用于同步鉴别禽流感、鸡传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性法氏囊病,以及现地主要流行的禽流感亚型,是一种有效的新方法。     

云南省土杂鸡呼吸系统疫病病因分析

为了分析云南省土杂鸡呼吸系统疫病病因,分别在云南省楚雄、安宁和石林等地采集出现呼吸系统疫病土杂鸡的喉气管、肺脏、脾脏等组织样品57份,采用RT-PCR或PCR方法对采集的样品进行新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鼻气管鸟杆菌、副鸡嗜血杆菌和支原体等传染性疫病病原核酸检测。结果表明:有3份样品检测显示新城疫病毒核酸呈阳性,阳性率为5.26%;4份样品检测显示禽流感病毒核酸呈阳性,阳性率为7.02%;1份样品检测显示鸡传染性支气管炎病毒核酸呈阳性,阳性率为1.75%;11份样品检测显示鸡传染性喉气管炎病毒核酸呈阳性,阳性率为19.30%;19份样品检测显示鼻气管鸟杆菌核酸呈阳性,阳性率为33.33%;28份样品检测显示副鸡嗜血杆菌核酸呈阳性,阳性率为49.12%;48份样品检测显示支原体核酸呈阳性,阳性率为84.21%;9份样品未检测到上述病原核酸,占检测总数的15.79%。说明云南省土杂鸡呼吸系统疫病由多种病原引起,其中以支原体和副鸡嗜血杆菌感染为主。     

新城疫病毒RT-PCR一步法的建立及应用

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法,根据GenBank上登录的NDV F基因序列,利用生物学软件设计合成一对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测NDV的RT-PCR一步法.该方法对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ngRNA.临床初步应用显示该检测方法特异性强、敏感性高,可以用于新城疫病毒的临床快速检测.     

H9亚型禽流感病毒TaqMan MGB荧光RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中发表的H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测H9亚型AIV的荧光RT-PCR方法,利用该方法和商品化试剂盒对临床样本同时进行检测。结果显示,该方法可特异性检测H9亚型AIV,与H3和H5亚型AIV、新城疫病毒、鸭病毒性肠炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合征病毒等主要禽病病毒无交叉反应;该方法检测范围为10-1~10-5个拷贝数,相关系数R2=0.997。对3个不同浓度的RNA进行组间和组内重复性试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于2.0%,具有良好的重复性。用本方法和商品化试剂盒对采集的349份野鸟粪便进行检测,两者具有高度的一致性(K=0.85),本研究建立的方法检测临床样本结果更接近真实值。本研究提供了一种快速、准确、敏感和特异的H9亚型AIV检测方法,可为临床诊断和流行病学调查提供可靠的检测依据。宁夏是中亚野鸟迁徙的主要旅居点,应加强野鸟和家禽群体的疫病监测,做到"早发现、早诊断、早处置"。     

检测新城疫病毒的纳米PCR技术建立与初步应用

根据Gen Bank登录的新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列设计引物,建立了NDV纳米PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对NDV的最低核酸检出量分别为27 pg,比传统PCR敏感10倍,可扩增出297 bp的特异性核酸片段,而对禽流感病毒、传染性法氏囊病毒与传染性支气管炎病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于新城疫病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

北美H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型禽流感病毒HA基因序列,根据该基因设计引物,建立了针对北美H7亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,并对反应条件进行了优化。该方法可特异地检出北美H7亚型禽流感病毒HA基因,而未检出欧亚分支H7亚型禽流感病毒H7N2和H7N9、其他亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H5N8和H9N2),以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达0.1 pg/μL。该检测方法的建立为监测北美H7亚型禽流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来禽流感病毒的检测。     

健康：规模化蛋鸡场稳定运营的基石

现代化规模蛋鸡场成功运营的一项重要任务就是,做好重要疫病的防控与生物安全措施的落实与执行。 通过对30个蛋鸡规模养殖企业的技术需求调查,表明：（1）禽流感、新城疫、传染性支气管炎、传染眭法氏囊炎、禽白血病、传染性喉气管炎是关注度较高的病毒性疾病,需要进行抗体和抗原监测。因抗原和试剂盒不统一,检测结果有较大的差异。（2）需要准确的免疫程序、最好减少免疫力次数。     

朗德鹅禽流感病毒的分离与鉴定

用禽流感病毒ELISA试剂盒对某朗德鹅养殖场的病鹅气管粘液进行了检测，发现5份粘液样本均呈禽流感阳性；随后取相应气管组织材料接种于9～11日龄鸡胚分离病毒．发现尿囊液能使鸡红细胞发生凝集，用禽流感病毒H5、H7、H9标准阳性血清和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒抗血清作HI试验，结果禽流感病毒H5亚型抗血清的血凝抑制滴度达到2^7，而禽流感病毒H7、H9亚型及其他病毒抗血清无血凝抑制滴度，说明从朗德鹅分离到的病毒为H5亚型禽流感病毒。     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

致鸡产蛋下降禽病原的检测基因诊断芯片的研制及临床应用

本试验研究的目的是利用RT-PCR技术扩增出新城疫病毒(NDV)、低致病性禽流感病毒(AIV H9)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征(EDS)、传染性喉气管炎病毒(ILT)、鸡毒支原体(MG)各一段保守序列,以纤维素酯膜作为生物芯片制作的基质,通过微量点样技术制作基因芯片(gene chip)。从可疑病料中提取组织核酸,通过掺入法bio-11-dUTP标记,对杂交信号的强弱检测来实现对生物样品的高效分析诊断。     

鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定

为对某鸡场发生的呼吸道疫病进行确诊,并对致病原进行分离和鉴定,本研究进行了发病鸡场临床诊断、病毒分离、分离毒株血凝试验、分离毒株RT-PCR检测以及序列分析等系列试验。试验结果显示,该病的临床特征疑似鸡传染性支气管炎病毒感染,临床病料样品接种鸡胚后可引起鸡胚死亡以及"侏儒胚"等典型症状,分离毒株无血凝性,分离毒株经传染性支气管炎病毒特异性引物检测为阳性,且序列分析显示RT-PCR扩增产物为鸡传染性支气管炎病毒特异性核苷酸序列,表明引起鸡场此次疫病的致病原为鸡传染性支气管炎病毒。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.