禽流感病毒重组核蛋白抗原的纯化及在琼脂免疫扩散试验中的应用

采用RT-PCR扩增我国H5N1禽流感病毒NP基因,亚克隆于含有组氨酸标签的原核表达载体中,在大肠杆菌中高效表达。所表达的蛋白经Ni 亲和色谱法纯化,SDS-PAGE电泳分析其纯度达95%以上,Western-Blotting鉴定具有良好的免疫反应活性。利用纯化蛋白作为诊断用抗原,建立了禽流感的琼脂扩散诊断方法。所建立的诊断方法在对禽流感强阳性和弱阳性血清的检测中,均出现了致密而清晰的沉淀线,且沉淀线的亮度与所加入的重组抗原的量成正比;而对鸡新城疫、鸡传染性法式囊等8种禽疫病阳性血清和SPF鸡血清的检测中,无沉淀线出现且没有交叉反应;利用该方法对30份进出口送检样品进行检测,其结果与国内同类试剂盒相符性达100%。实验室和现地使用证明,利用纯化的重组NP抗原所建立的方法简便、可靠、易于标准化,可为我国禽流感的兽医诊断、流行病学普查和出入境检验检疫提供有力的保障。     

禽流感病毒核蛋白基因探针制备及其初步应用

将禽流感病毒Ｈ９Ｎ２ 亚型毒株核蛋白（ＮＰ）基因３′端较为保守的、约３５０ｂｐ 的编码序列通过限制性内切酶ＨａｅⅢ切割、分离后,用随机引物法制备Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ１１ｄＵＴＰ标记探针。测定该探针的浓度为１００μｇ／ｍ ｌ。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有ＮＰ基因的重组载体ｐＧＥＭＴＥＮＰ和ｐＢａｃＰＡＫＮＰ以及Ａ 型流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型、Ｈ３Ｎ２ 亚型以及Ｈ９Ｎ３ 亚型毒株基因组ＲＮＡ 结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载体ｐＧＥＭＴ ｅａｓｙ、ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ ３、ｐＴＡＲＧＥＴ 和ｐＧＥＭＥＸ２ 以及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒基因组不发生反应。应用该探针检测含ＮＰ基因的重组载体和重组病毒证明该探针是有效的,可用于含禽流感病毒样品或材料的检测。     

禽流感病毒核蛋白基因的原核表达及其生物学活性分析

禽流感病毒(A v ian in fluenza v irus,A IV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染或/和疾病综合征[1,2],是被世界动物卫生组织(O IE)确定的I类烈性传染病。该病自1878年在意大利鸡群首次暴发以来,已对养殖业造成了严重的经济损失。近年来,我国各地及世界上许多国家都有禽流感     

猪流感病毒血凝素基因原核表达及其在间接ELISA中的初步应用

利用RT-PCR方法扩增猪流感病毒A/Swine/Henan/11/2005(H1N1)血凝素(HA)基因,克隆于pMD18-T载体进行测序。以pMD18-HA为模板、利用带酶切位点的引物再次扩增HA基因的开放阅读框(ORF),克隆到表达载体pET32a中,经双酶切、测序及PCR鉴定得到阳性重组表达质粒pET-HA,将质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,HA蛋白获得了高效表达,经Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫学活性,在间接ELISA中的初步应用表明具有良好的抗原反应性。本研究为以重组HA蛋白为抗原建立H1亚型猪流感抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒（RV）核蛋白抗原，采用RT—PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了RV核蛋白基因，分别亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）和pET-32a（＋）中，经PCR和双酶切鉴定以及序列测定，重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，表达的核蛋白再经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化。结果显示，核蛋白在pET-32a（＋）中的表达量（30．4％）高于在pET-28a（＋）中的表达量（19．4％），培养物中的高纯度核蛋白产量分别为13．6和8．45mg／L。经Western—blotting检测，不同载体表达的核蛋白均可被兔抗RV多克隆抗体特异识别，表明核蛋白具有良好的反应原性。     

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因,其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致,与其它毒株则有较大差异,说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中,再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中,经过三次蚀斑筛选,获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ,结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH－1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30的多克隆位点中，经鉴定后得到重组质粒pET30a-N，将此重组质粒转化到受体菌BL21中，用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS－PAGE、Western-blot分析，并以此为包被抗原进行ELISA检测，结果发现以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导，4小时后表达可达到高峰，其大小约为23kD，薄层扫描结果表明庐蛋白表达量约占菌体蛋白总量的32％，该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应，而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别，证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBond^TM纯化系统进行纯化，其纯度可达到91％，纯化后的蛋白以50μg/孔包被96孔板，检测来自不同地区送检的猪血清，同时以全病毒ELISA为对照，结果发现二者的符合率高达93．3％，而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感，且背景低，制备过程简单，这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。     

禽流感病毒重组核蛋白在琼扩诊断中的应用

利用杆状病毒表达禽流感病毒型特异性抗原－核蛋白,并就重组核蛋白作为禽流感琼扩诊断抗原地特异性和敏感性及作为抗原的其它特性进行了研究,并与普通全病毒琼扩抗原进行了应用比较试验,对３５４份现地可疑血清样品进行了检测,结果表明：该抗原可以特异性地定性检测出所有１５个禽流感病毒亚型的抗血清,与普通全病毒琼扩抗原的检测结果一致,但沉淀线更细密、清晰,保存方便;与我国广泛流行的１５种禽类其它病原体的抗血清没有任何交叉反应,表明该重组核蛋白作为禽流感琼扩抗原特异、敏感、生物安全性更可靠和生产成本更低廉,有利于进一步扩大禽流感疫情调查范围和加大监测力度。     

狂犬病病毒核蛋白基因的克隆序列分析及其在E.coli中的高效表达

对狂犬病病毒（RV）ERA株核蛋白（N）基因进行了克隆和序列分析。根据GenBank中已发表的RVN基因序列，设计合成了1对特异性引物，对RV ERA株N基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pMD18T连接得到重组质粒pMD-N，并进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1353bp，编码450个氨基酸。RV ERA株与CVS-11、PV-11、SRV9和SAD—B19株相比，核苷酸的同源性分别为98％、98．3％、99％、99.6％，推导的氨基酸的同源性分别为98％、99％、99％、99.6％。将pMD-N双酶切，回收目的基因片段并克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，构建了重组质粒pETN；将其转化表达菌BL21（DE3）并用IPTG进行诱导表达。结果重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为53kDa的重组蛋白。经凝胶薄层扫描分析，重组蛋白表达量占菌体蛋白的56．8％，Western-blot结果显示该重组蛋白能与RV多克隆抗体发生特异性反应。     

仙台病毒核蛋白的原核表达及鉴定

本研究从一株鼠仙台病毒（Sendai virus,SeV）中扩增获得核蛋白（nucleocapsid protein,NP）基因,将其克隆入pET32a（＋）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。将原核表达产物作为免疫原,免疫BALB/C小鼠,制备获得抗NP的特异性多抗,经间接免疫荧光法和Western blot法检测,该表达产物原具有良好的免疫原性。将该产物纯化作为包被抗原,建立了一种检测SeV感染的间接ELISA方法。通过H1N1流感病毒、H9N2流感病毒、新城疫病毒阳性血清进行交叉试验表明：该间接ELISA方法有很好的特异性。这为实验动物仙台病毒抗体的检测提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立

根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法.使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线.其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白在ELISA中的应用

猪传染性胃肠炎(TGE)是引起猪腹泻的病毒性传染病,感染猪的主要临床症状是腹泻、呕吐和脱水,不同年龄的猪均易感,尤其两周龄以内的猪死亡率可达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失.因此开展猪传染性胃肠炎诊断方法的研究对该病的防制具有重要意义.     

Serological evidence for influenza virus infection in Korean wild boars

Serum samples from 1,011 wild boars hunted in 2012 were collected for serological surveillance for 4 subtypes (pandemic A (H1N1) 2009 and classical H1N1, H1N2 and H3N2) of swine influenza virus (SIV). Samples from 12 of the boars were identified as positive for SIV (pandemic A (H1N1) 2009, n=9; classical H1N1, n=2; and H1N2, n=1) by a hemagglutination inhibition test (HI test) and a nucleoprotein (NP)-based enzyme-linked immunosorbent assay (NP-ELISA). Although the overall seroprevalence of SIV in the Korean wild boar population was somewhat low compared with that in China and the U.S.A., the apparent prevalence of pandemic H1N1 was notable. Therefore, continuous monitoring of the wild boar population is needed as it may be a major reservoir for pandemic H1N1, facilitating its spread to humans and domestic pigs.     

华南地区猪群猪流感病毒病原学和血清学调查

为了解华南地区猪群中猪流感病毒(SIV)的流行及其遗传变异情况,本研究从2016年~2017年广东、广西等地猪群236份猪肺脏病料组织和143份鼻拭子样品中分离鉴定得到3株SIV,全基因组测序和遗传演化分析结果显示,3个分离株均属于H1N1亚型欧亚类禽分支SIV,并且均与pdm09分支病毒株发生了重组。HA蛋白分子特征分析结果显示,A/Swine/Guangxi/NK/2016 HA蛋白第23位糖基化位点发生了缺失。3265份血清样品抗体监测结果显示,欧亚类禽H1N1、pdm09 H1N1和H3N2 SIV的血清抗体阳性率分别为27.53%、20.98%和34.85%。另外,0.64%的(21份)血清样品为H9N2亚型流感病毒抗体阳性,并且猪群中不同亚型和不同分支SIV之间混合感染的情况非常普遍。猪群中流感病毒血清抗体监测结果显示,EA H1N1、pdm09和H3N2亚型SIV HI抗体滴度最高均可达到1:1280,而H9N2亚型HI抗体滴度最高为1:160,表明H9N2 AIV虽然可以感染猪,但对猪还不适应。各月份的血清抗体阳性率分析显示,SIV的流行具有季节性,冬季(11月、12月和1月份)的流行最为严重。本研究可为华南地区猪群SI防控及疫苗株的筛选提供参考依据。     

Replicon particle vaccine protects swine against influenza

An alphavirus derived replicon particle (RP) vaccine expressing the cluster IV H3N2 swine influenza virus (SIV) hemagglutinin (HA) gene induced protective immunity against homologous influenza virus challenge. However, pigs with maternal antibody had no protective immunity against challenge after vaccination with RP vaccines expressing HA gene alone or in combination with nucleoprotein gene.     

利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体

为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。     

猪流感病毒的分离鉴定及特性测定

猪流感(SI)是由猪流感病毒(SIV)引起的猪的一种呼吸道传染病,目前我国主要流行H 1和H 3亚型[2],H 9N 2等亚型也见报道[3]。该病是一种免疫抑制病[1],感染后会抑制其他疫苗的免疫效果,易导致其他病原体混合感染,给养殖业造成巨大的经济损失。由于流感病毒基因组易发生变异,猪又是产生重组病毒的“混合器”,如20世纪90年代在意大利猪体内就发现了禽与人流感病毒重组体[4],如果产生一种可以在人群中传播的新型流感病毒,将造成极大危害,故及时掌握猪流感流行情况及进行有效的防制,具有重要的兽医流行病学和公共卫生学意义。本试验旨在对河北…     

猪流感病毒分子生物学研究进展

猪流感（Swine influenza，SI）是由猪流感病毒（SIV）引起的一种急性高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，其特征为突发咳嗽、呼吸困难、发热、衰竭及迅速康复，猪不分年龄、品种和性别均能感染，是规模化猪场普遍存在难以根治的群发性疾病之一。     

猪流感病毒分子生物学研究

猪流感病毒主要引起一种急性高度接触传染性的群发性呼吸道疾病。本文主要论述了猪流感病毒分子生物学特性、基因组结构及其功能等方面的研究。