农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素。基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株。经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cry1 Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7%。通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料。     

抗虫耐草甘膦双价基因表达载体的构建及玉米转化

本研究对来自苏云金芽胞杆菌BT8的Cry1A(h)基因根据玉米密码子偏好性进行了优化。采用重叠PCR方法获得了优化的Cry1Ah基因与抗除草剂基因2m G2-epsps融合片段,并将其构建到植物表达载体p BI121上,构建p BI121-EPSPS-cryl Ah双元载体。将其转化根癌农杆菌菌株EHA105,获得基因工程菌。结果表明,玉米生产上使用的骨干优良自交系18599、综31等的幼胚作为转基因受体材料,以工程菌将抗虫抗除草剂双价基因转入上述玉米幼胚,经共培养、恢复、筛选、分化、生根、壮苗移栽等培养,苗期除草剂草甘膦涂抹,免疫试纸条检测、抗虫接种鉴定等初筛,再经PCR验证,获得了4株双抗转基因材料。此结果将为抗虫抗除草剂双抗转基因玉米新品种选育提供较好的亲本材料。     

抗虫Cry2Ab基因的原核表达及玉米的遗传转化

玉米的产量深受虫害的影响,抗虫Cry2Ab基因对玉米黏虫抗性有重要意义。利用外源抗虫基因Cry2Ab构建到原核表达载体pET-22b中,对其进行SDS-PAGE检测和抗黏虫性鉴定。SDS-PAGE检测结果表明,Cry2Ab基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌BL21中得到正确的表达,条带大小为70.68 kD;抗黏虫性鉴定结果表明,当Cry2Ab蛋白浓度为100μg/g时,对东方黏虫致死率达到86.66%。同时构建pCAMBIA3301-Cry2Ab-Bar植物表达载体,通过农杆菌介导法将外源抗虫基因Cry2Ab转入玉米自交系GSH9901愈伤组织中,利用除草剂筛选及PCR技术检测得到T₁转基因阳性植株4株。获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

Hi-Ⅱ玉米的NGc抗虫基因遗传转化研究

为促进转基因抗虫玉米研究,通过农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化法将目的基因转入玉米材料Hi-Ⅱ中,通过外植体侵染、共培养以及分化筛选,培养具有CryNGc抗虫基因的玉米植株,并研究外源基因在后代的遗传表达及抗性情况.结果表明:玉米幼胚大小在1.2～1.8mm时侵染效果最好,并成功获得了10株具有Cry NGc抗虫基因的阳性...     

超声波辅助花粉介导法获得转BtCry1Ac基因玉米的研究

为了进一步分析玉米基因功能及基因转化,并为玉米抗虫提供种质资源,利用超声波辅助花粉介导法,将抗虫基因Cry1Ac导入玉米优良自交系昌7-2中,获得大量的转基因植株。结果表明:转基因植株经过草铵膦抗性筛选、PCR检测、BT蛋白试纸条检测和室内抗虫性鉴定等分析,最后获得高抗玉米螟的转BtCry1Ac基因株系9个。培育出了高抗玉米螟的种质资源材料,同时也建立了超声波辅助花粉介导转化玉米的高效转化体系,该方法是简捷、快速有效、无基因型限制的植物转化方法。     

农杆菌介导抗虫基因Cry1Ac/Ab转化大豆的研究

利用农杆菌介导的子叶节遗传转化体系,将Cry1Ac/Ab融合抗虫基因表达载体导入栽培大豆品种GP03-8-23中,通过Cry1Ac/Ab融合基因在大豆中的表达,获得了抗虫转基因大豆新材料。试验共转化子叶节外植体1 540个,再生转化苗经PCR、Southern杂交和Bar试纸条检测,获得85株阳性转基因植株,平均转化率为5.47%。利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测了目标基因在转基因大豆不同株系及不同组织中的表达量。结果表明:不同转基因株系表达量存在显著差异,目标基因在大豆根、茎、叶、子粒中均有表达,在叶中的表达量最高,根中的表达量较高,茎和子粒中的表达量最低。经室内抗食叶性害虫离体鉴定,获得抗虫性较好的T1代转Cry1Ac/Ab基因大豆材料,其中1份表现为高抗,抗虫性显著优于对照,可为培育抗虫大豆新品系提供新的种质材料。     

Agrobacterium-mediated Cryl Ab/Ac gene transformation in maize

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素.基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cryl Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株.经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cryl Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7％.通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料.     

基于TaqMan实时荧光PCR检测植物中转基因成分

转基因植物的安全性一直备受关注,转基因成分检测是保障食品安全、维护消费者知情权的重要手段。本研究构建并鉴定了pCry3A、pCry1A (c)、pCP4-EPSPS和p CTP2-CP4-EPSPS 4种阳性质粒,并在转基因棉花、转基因大豆、转基因小麦、转基因玉米、非转基因玉米中分别检测玉米内源基因(adh1)、抗虫基因(Cry3A、Cry1A (c))和抗除草剂基因(CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS),最后将转基因棉花和转基因大豆DNA模板原液进行梯度稀释确定Cry1A (c)和CP4-EPSPS的检出限,通过检出限检测建立标准曲线确定此方法的转基因成分定量检测能力。结果表明:4种阳性质粒鉴定结果良好,可以作为转基因检测的阳性对照;转基因棉花为转入Cry1A (c)基因的抗虫棉;转基因大豆为转入CP4-EPSPS基因的抗除草剂大豆;转基因小麦为转入Cry1A (c)基因的抗虫小麦;转基因玉米为转入Cry1A (c)、CP4-EPSPS、CTP2-CP4-EPSPS基因的混合转基因玉米; Cry1A (c)和CP4-EPSPS的引物和探针的检出限均可达0. 1ng;建立的2种标准曲线的R2≥0. 95,说明引物和探针可以满足定量检测要求。本研究对Taq Man实时荧光PCR法检测植物中的转基因成分提供一些借鉴,同时为保障食品安全、维护消费者知情权提供方法支持。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

抗虫基因在湘杂棉22号F1与F2代中的表达及遗传稳定性研究

以转基因抗虫棉湘杂棉22号为研究材料,利用PCR和ELISA检测方法,分析了CryIAc基因与NptⅡ基因在F1与F2代材料中的表达及遗传稳定性情况.结果显示,外来抗虫基因在F1代中稳定存在,且稳定表达.F2代检测样本中5%的个体出现基因沉默,表达个体中的表达量存在差异.Cry1Ac基因与NptⅡ基因呈现紧密连锁关系,...     

抗虫基因Cry1C转化大豆的研究

[目的]将对鳞翅目害虫具有抗性的抗虫基因Cry1C转入大豆中,获得对田间鳞翅目害虫具有抗性的大豆材料.[方法]利用农杆菌介导法将抗虫基因CrylC转入大豆品种Williams82中,并通过Bar试纸条及PCR方法对所获得的转化苗进行鉴定.[结果]获得28株阳性大豆转化植株.[结论]初步认定CryIC基因已整合到大豆基因组中.     

利用农杆菌介导的共转化法获得含双Bt基因转基因水稻

利用农杆菌介导的共转化法,将分别携带不同Bt抗虫基因Cry1C*和Cry2A*的两个植物表达载体同时导入吉林省主栽超级粳稻品种吉粳88中,获得598株草丁膦(Basta)抗性独立转化植株。以Cry1C*和Cry2A*特异性引物对独立转化植株进行双引物PCR扩增,结果得到35株Cry1C*和Cry2A*基因双阳性植株,双基因共转化率为6.28%。以目的基因Cry1C*和Cry2A*为探针进行Southern blot分析,获得3个双基因单拷贝株系。利用RT-PCR检测Bt基因在这3个株系中的mRNA表达情况,结果表明两个Bt基因在转录水平上同时得到了有效表达。     

[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因在玉米中的转化与筛选

为获得转基因抗虫玉米,将[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因导入玉米,并进行鉴定和筛选。在[反]-β-法尼烯(EβF)合成酶基因的两端分别添加Nco I和Bam H I酶切位点,并进行人工合成。将EβF合成酶基因与植物表达载体p FGC5941连接,经双酶切和测序鉴定。结果表明:重组表达载体p FGC5941-EβF构建成功;载体p FGC5941-EβF转化农杆菌EHA105后用玉米芽尖侵染法将EβF合成酶基因导入玉米自交系郑58中,对转化植株进行除草剂抗性筛选以及EβF合成酶基因和bar基因的PCR鉴定后,共得到18株转基因阳性植株。     

基于MPCR法检测抗虫与耐除草剂转基因玉米Bt1

为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系。结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT=0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测。     

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为构建抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11的多重PCR检测方法,根据抗虫和耐除草剂玉米Bt11分子特征,同时选择玉米内源参照基因zSSIIb、外源基因Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT 5个基因作为MPCR检测基因,参照国家相关标准中特异性引物序列,通过对反应条件的优化以及方法特异性和灵敏度测试,建立MPCR检测体系.结果表明:利用已知样品对体系(退火温度为56℃,模板浓度≥200bp,引物配比为zSSIIb∶Cry1Ab∶P-CaMV 35S∶T-NOS∶PAT =0.1∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2)验证,抗虫和耐除草剂玉米Bt11能同时被检出zSSIIb、Cry1Ab、P-CaMV 35S、T-NOS和PAT等5个基因,而其他样品均不能被同时检出这5个基因,建立体系可用于抗虫和耐除草剂转基因玉米Bt11检测.     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

抗虫基因Cry1Iem转化大豆的研究

通过花粉管通道法将pCMBIA3300-Cry1Iem载体中的Cry1Iem基因转入大豆品种"吉农28"中,对经过抗草铵膦筛选的转基因植株进行PCR检测,初步确定阳性植株,对转基因阳性植株进行Southern blotting检测,结果发现有5株出现杂交信号,证明Cry1Iem基因整合到受体的基因组中。利用实时荧光定量PCR测定T1代阳性植株的Cry1Iem基因在mRNA水平上的表达量,证明Cry1Iem基因在受体材料中获得了表达。     

转Bt基因油菜的抗虫性分析

利用农杆菌介导的遗传转化分别将Cry1C和Cry2A的2个单价Bt基因转入油菜(Brassica napus L.),以两个纯合的转基因抗虫油菜为亲本,通过有性杂交的方法将不同Bt基因聚合,培育双价Bt抗虫油菜,并对其抗虫性和种子品质性状进行评价。结果表明,Cry1C、Cry2A在聚合后均能稳定表达,和单价Cry1C转基因植株相比,双价株系中蛋白质含量明显降低,以Cry2A为母本的聚合株系蛋白质含量降低更多,Cry1C在遗传上存在母本效应。室内接种小菜蛾二龄幼虫结果显示,转化单价和双价聚合Bt基因的抗虫性增强,其中转化单价Cry1C的抗虫性优于双价聚合Bt基因和单价Cry2A基因的转基因植株。玻璃温室栽培转基因植株,单价Bt和双价聚合Bt基因的转基因植株能生存而非转基因植株受到严重虫害而死亡。对抗性优良的单价和双价聚合的转基因植株种子品质测定发现,与未受到虫害的受体材料双低优良恢复系7-5的含油量和硫苷含量差异不显著,从而达到抗性改良的目的。     

农杆菌介导葡萄糖氧化酶基因转化油菜

以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体材料,采用农杆菌介导法进行葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GO)基因的转化,经卡那霉素抗性筛选获得大量的不定芽.PCR检测结果显示其中22株呈阳性.淀粉-KI染色结果表明在转基因植株中检测到H2O2.在转基因植株×非转基因植株(F1代)中,卡那霉素抗性筛选显示86%的株系呈现典型的孟德尔单基因显性遗传.F1代盛花期茎秆菌核病活体接种结果证实,转基因植株后代菌核病抗性明显提高.证实GO基因已转入油菜植株中并得到有效表达.     

玉米转基因技术研究现状及发展趋势

自1990年可育的转基因玉米问世以来,玉米转基因技术一直是国内外作物转基因研究的热点之一,并在玉米育种中发挥了巨大作用.使用农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法等转化技术,将不同来源的单个和多个功能基因转入玉米,对玉米重要农艺性状进行遗传改良,在培育抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆等转基因新品种方面取得了巨大进展.论述了玉米转基因技术的研究进展,并对育种中存在的问题提出了一些看法.