牛体外受精囊胚双重染色方法的优化

为建立快速、可靠的评估牛囊胚质量的双重染色方法,对目前已建立的4种双重染色方案进行了改进。结果显示:改进的方案一、方案三及方案四都能达到牛囊胚双重染色的效果;改进的方案三、方案四囊胚细胞总数与Hoechst33342染色结果无差异(84.33个±9.98个VS 83.63个±9.74个,P0.05;93.00个±10.50个VS 83.63个±9.74个,P0.05),而且囊胚内细胞团(ICM)数与囊胚细胞总数的比值分别为0.338 2与0.335 6,均接近标准值0.33;改进的方案四染色最为稳定,效果较好,整个染色时间由原来的12 h(过夜)降到不到3 min,极大地提高了染色效率,可以作为一种快速、简洁、有效的牛囊胚质量鉴别方法。     

双重荧光染色法评定小鼠体内外囊胚质量的研究

研究并建立适合小鼠囊胚的双重荧光染色方法。用建立的双重荧光染色法对小鼠体内外囊胚细胞计数,分别计数囊胚不同时期的内细胞团和滋养层的细胞数,比较不同发育时期囊胚的内细胞团和滋养层细胞的比例,评定体内外囊胚质量。     

不同氮源对山羊回肠黏膜上皮细胞凋亡的影响

试验旨在研究以蛋氨酸(Met)、NH₄Cl为不同氮源对山羊回肠黏膜上皮细胞凋亡的影响。试验采用细胞增殖试验、Hochest33342染色荧光显微镜检测、流式细胞术检测、线粒体膜电位的检测、检测凋亡关键蛋白的表达、观察通路关键蛋白表达等方法进行研究。结果显示,以无机氮源NH₄Cl代替有机氮源Met诱导回肠上皮细胞发生细胞体积缩小、细胞核固缩及由此引起的荧光染色颗粒增亮等形态学变化,发生线粒体膜电位和凋亡关键蛋白的表达显著下调(P<0.05),细胞发生凋亡。凋亡的发生促使促凋亡蛋白半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、P53抑癌基因(p53)和BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)的表达显著上调(P<0.05),而抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤因子2 xl(Bcl-xl)显著下调(P<0.05)。研究表明,Met缺失组和0.20 mmol/L NH₄Cl组均通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通...     

脂多糖对牛乳腺上皮细胞自噬和凋亡的影响

为探究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T)自噬和凋亡的影响，以MAC-T细胞为试验对象，用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)法检测不同浓度LPS(100、150、200、250μg/mL),检测细胞的存活率和损伤，从上述分组中挑选浓度为0(对照)、50、100、200μg/mL的LPS建立试验组，Hoechst33342检测细胞核形态，qPCR法检测MAC-T细胞中自噬和凋亡基因(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)mRNA的表达量，Western blot检测MAC-T细胞中自噬和凋亡(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)相关蛋白表达。结果显示，MAC-T细胞的活力会随着LPS的浓度和时间的推移下降，细胞上清中的LDH随着LPS浓度上升而增加，Hoechst33342染色后可以发现细胞核形态出现异型性，染色质碎裂、固缩。qPCR和Western blot检测结果显示LPS在50～100μg/mL浓度下可引起MAC-T细...     

单胚胎RT-qPCR对猪体细胞核移植囊胚全能性的分析

为了检测猪体细胞核移植囊胚的质量和全能性基因表达量,采用体细胞核移植技术制备克隆胚胎并于体外培养5 d后获得囊胚,对照组为从人工授精5 d后的长白母猪体内获取的体内囊胚。在高倍镜下检测两组囊胚的形态,用Hoechest 33342染色细胞核DNA,记录囊胚细胞总数;建立单胚胎cDNA的制备方法,并用qPCR检测囊胚中全能性基因(Oct4、Nanog、Sox2)的表达量。结果表明,与体内囊胚相比,猪体细胞核移植囊胚质量较差,细胞数目显著降低(分别为110±10.3和54±12.6);并且全能性基因表达量显著下降(P<0.05)。由此可见,全能性基因表达量偏低是影响猪体细胞核移植囊胚发育能力的因素之一。     

冬虫夏草菌丝粗多糖对SP2/0细胞凋亡和p53表达的影响

观察冬虫夏草菌丝粗多糖对SP2／0细胞凋亡诱导和p53基因表达的影响。在体外用粗多糖处理SP2／0细胞,MTT法检测其对肿瘤细胞增殖抑制作用,Hochest33342荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞的周期,实时荧光定量PCR检测p53基因的表达情况。结果发现,与对照组相比,冬虫夏草粗多糖可抑制SP2／0细胞增殖,诱导出现典型凋亡形态变化,电泳出现特有梯形条带,引起细胞周期阻滞,使p53基因的表达明显改变。这提示冬虫夏草粗多糖对SP2／0细胞生长的抑制,可能与诱导凋亡和声53基因表达的改变有关。     

玻璃化冷冻对猪孤雌激活囊胚中细胞凋亡的影响

旨在研究玻璃化冷冻对猪孤雌激活囊胚中细胞凋亡的影响。通过体外培养观察冷冻-解冻后囊胚腔的恢复情况,JC-1检测线粒体膜电位变化、TUNEL法检测胚胎中细胞凋亡水平,免疫荧光分析多种Caspase活性,以及qRT-PCR检测凋亡相关功能基因的mRNA表达水平。结果表明,冷冻-解冻后囊胚的囊胚腔恢复率(31.03%)和囊胚细胞数(31.81)与新鲜囊胚(100.00%和38.17)相比均显著下降(P0.05)。冷冻后囊胚的线粒体膜电位(0.46)与新鲜囊胚(1.02)相比显著下降(P0.05)。TUNEL凋亡染色后,冷冻囊胚中凋亡阳性细胞的比例(10.13%)显著高于新鲜囊胚(5.92%,P0.05)。Caspase原位荧光染色结果表明,Pan-caspase、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3冷冻-解冻囊胚的荧光强度值(20.65、20.60、17.58和19.88)均显著高于新鲜囊胚(7.41、6.46、5.47和6.32,P0.05)。经qRT-PCR检测,冷冻组中Caspase-8、Caspase-9、TNF-α基因的mRNA表达水平均显著高于新鲜组(P0.05),BCL-2、SOD-1的mRNA表达水平则显著低于新鲜组(P0.05)。综上表明,玻璃化冷冻可造成猪孤雌激活囊胚线粒体功能下降,并在死亡受体和线粒体途径上共同介导囊胚内细胞凋亡的发生。     

6种荧光蛋白基因在蒙古羊成纤维细胞中的表达

采用脂质体介导法，将绿色荧光蛋白（pEGFP—C1、pEGFP-N3）、增强型青色荧光蛋白（pECFP—N1、pECFP—mito）、黄色荧光蛋白（pEYFP—N1）和红色荧光蛋白（pDsRed1—N1）等6种荧光蛋白基因导入蒙古羊体外培养成纤维细胞中，对基因的时空表达、阳性细胞生长与增殖状况、细胞凋亡与细胞活力以及提高基因表达率的最佳方法等方面进行了深入的研究。试验结果表明：6种荧光蛋白基因在转染后24、48和72h的转染率在12．3％～63．3％之间，经多重比较，各试验组之间有较大差异。转染24h后，6种荧光蛋白都均匀地充满细胞质和细胞核，只有囊状小泡没有标记荧光；转染48h后，EGFP、ECFP和EYFP仍在整个细胞中均匀表达，呈弥散分布状态，随着表达量的增加，在细胞核局部呈现块状或颗粒状的基因表达产物；DsRed荧光蛋白基因则主要在细胞核膜周围呈现由诸多颗粒状表达产物组成的环状轮廓；在优化的条件下，细胞凋亡率、阳性细胞的形态、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著（P〉0．05）。本研究结果对于标记基因、核移植及转基因动物克隆等研究具有重要的参考价值。     

ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能研究

旨在探究缺失、小的、同源异形1(absent, small, or homeotic 1-like,ASH1L)甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达与功能。本研究通过免疫荧光染色在健康母牛卵丘细胞中对ASH1L甲基转移酶进行定位,并分析细胞的组蛋白H3第36位赖氨酸(histone H3 lysine36, H3K36)甲基化修饰模式;合成靶向Ash1L基因的siRNA,对siRNA-1、 siRNA-2、siRNA-3及对照组进行荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹,筛选有效siRNA;采用荧光定量PCR分析干扰Ash1L表达对处理组及对照组中凋亡相关基因及多梳抑制复合体(polycomb repressive complex 2, PRC2)组成基因的表达水平的影响。结果显示,ASH1L甲基转移酶位于牛卵丘细胞的细胞核中,呈点状分布。成功筛选到能有效干扰牛Ash1L基因的siRNA-2,其干扰效率为60%～70%。将siRNA-2转染卵丘细胞后,该干扰组细胞中H3K36的单甲基化、二甲基化及三甲基化3种甲基化水平均显著低于对照组(P0.05);干扰Ash1L导致凋亡相关基因Bax、Bcl-2及caspase-3表达水平显著上调,凋亡基因Bax和caspase-3表达量高于抗凋亡相关基因Bcl-2(1.311和1.179 vs 1.146);同时,干扰Ash1L基因表达也引起PRC2蛋白亚基EZH2和Suz12基因的mRNA表达量显著升高(P0.05)。综上所述,本研究探讨了ASH1L甲基转移酶在牛卵丘细胞中的表达和功能,ASH1L在牛卵丘细胞中呈点状分布,且Ash1L基因的抑制导致H3K36me1/2/3水平均显著下降及凋亡基因和PRC2蛋白相关亚基EZH2和Suz12基因表达的升高,为进一步研究其对家畜胚胎的调控作用提供技术和理论基础。     

甘草酸单铵盐对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

将收集的猪COCs置于添加不同浓度(0.0,0.3,0.6,1.2μmol/L)甘草酸单铵盐(monoammonium glycyrrhizinate, MAG)的卵母细胞体外成熟培养液中培养46 h,统计成熟率，通过免疫荧光染色检测成熟卵母细胞ROS表达水平；对成熟卵母细胞体外受精，于胚胎培养液内体外培养48,120 h,分别统计体外受精胚胎卵裂率、囊胚率，并用Hochest荧光染色检测囊胚总细胞数；结合成熟率及IVF胚胎发育囊胚率选定最佳添加浓度，在体外成熟培养液中添加最适浓度MAG,以0μmol/L MAG为对照组，体外培养46 h后，利用免疫荧光染色检测猪成熟卵母细胞的线粒体膜电位水平和细胞凋亡水平。结果显示，与对照组相比，不同浓度MAG处理组猪卵母细胞体外成熟率均有所提高，但差异均不显著(P>0.05);不同浓度MAG添加均可降低猪卵母细胞ROS水平，与对照组相比，0.3,0.6μmol/L组差异显著(P<0.05),1.2μmol/L组差异极显著(P<0.01)。0.3μmol/L添加组显著提高了猪体外受精囊胚率(P<0.05),但不同MAG添加组对...     

以囊胚双重染色方法检验果糖对牛胚胎早期发育效果的影响

作为葡萄糖同分异构体的果糖同样可以作为胚胎早期发育的代谢底物,而且可能在桑椹胚发育阶段之前就为胚胎发育所利用,有利于早期胚胎的体外发育。本实验结合囊胚细胞双重染色方法研究了在SOFaaci培养基中,果糖代替葡萄糖对牛早期胚胎体外发育效果的影响。结果表明:对第8天囊胚双重染色时,以Triton X-100处理60~69 s为宜,内细胞团(TCM)细胞数和囊胚细胞总数分别为48.2±12.4和142.5±30.1,二者之比约为0.33;果糖组与葡萄糖组卵裂率(62.2±3.87 vs 60.7±2.89)、囊胚率(32.0±1.73 vs 29.7±4.16),TCM细胞数(43.6±14.5 vs 40.2±11.3)和滋养层(TE)细胞数(99.3±26.7 vs 89.9±24.8)差异也不显著(P>0.05)。但是数据显示,果糖组囊胚细胞总数要高于葡萄糖组(142.3±21 vs 136.2±35)(P>0.05),说明果糖可以代替葡萄糖作为早期胚胎体外培养的能量代谢底物,而且可以提高囊胚质量。     

柠檬苦素对小鼠卵母细胞体外成熟及其体外受精胚胎发育的影响

【目的】研究柠檬苦素(limonin,Lim)对小鼠卵母细胞体外成熟(IVM)及后续体外受精(IVF)胚胎发育潜能的影响,旨在为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】在小鼠体外成熟培养液中添加不同浓度的Lim(0、10、20、50 μmol/L),成熟培养12 h后统计小鼠卵母细胞第一极体(PBI)排出率,筛选体外成熟培养液中添加Lim的最适浓度;在体外成熟培养液中添加最适浓度的Lim,以0 μmol/L Lim为对照组,成熟培养12 h,通过免疫荧光染色检测活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)以及线粒体膜电位(MMP)水平;通过实时荧光定量PCR检测卵母细胞抗氧化及凋亡相关基因的mRNA表达水平。将最适Lim组及对照组卵母细胞体外成熟24 h后进行体外受精,于体外受精24 h和3.5 d分别统计胚胎卵裂率和囊胚率,并用Fluorescein-dUTP和Hoechst 33342染色分别检测囊胚总细胞数及囊胚内凋亡细胞比率。【结果】与0 μmol/L Lim组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞PBI排出率显著升高(P＜0.05),后续试验均用20 μmol/L Lim进行处理。与对照组组相比,20 μmol/L Lim组小鼠卵母细胞内ROS水平显著降低(P＜0.05),GSH、MMP水平均显著增加(P＜0.05),抗氧化相关基因(GPx3、CAT和Prdx3)、抗凋亡相关基因(Bcl-2、Bcl-xl)表达水平均显著上调(P＜0.05),促凋亡相关基因(Caspase-3)表达水平显著下调(P＜0.05);体外受精胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数均显著增加(P＜0.05),囊胚内细胞凋亡比率显著下降(P＜0.05)。【结论】在体外成熟培养液中添加20 μmol/L Lim可以通过抑制氧化应激和细胞凋亡、增加MMP水平提高小鼠卵母细胞质量,从而提高体外受精胚胎的发育潜力。     

动物细胞大规模培养中细胞凋亡检测方法的研究

为了探讨动物细胞大规模培养中细胞凋亡的检测方法,以不同浓度氯化铵诱导BHK-21细胞凋亡,每隔12 h收集细胞,采用台盼兰形态学排染法、吖啶橙和溴化乙锭双重荧光染色法、FITC-Annexin V/PI双染色荧光显微镜观察法、原位缺口末端标记法(TUNEL)、DNA凝胶电泳、流式细胞术(FCM)法进行细胞凋亡的检测。通过比较发现,不同方法检测结果都存在着显著性差异,但吖啶橙和溴化乙锭双重荧光染色法是一种简单、易行、准确、全面定性细胞凋亡的较为可靠的方法,而FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞仪能特异地、准确地检出早期凋亡的细胞,是较为理想的凋亡定量检测方法。这2种方法的联合运用更适应于动物细胞大规模培养过程中细胞凋亡的检测。     

兔脑炎原虫致脑细胞凋亡的信号转导通路的研究

为探讨兔脑炎原虫引起脑组织细胞凋亡的信号转导通路,本试验用普通染色、特殊染色、免疫组化染色和Western blot检测等方法,对40只病兔和10只对照兔的脑组织进行了研究。结果显示,病兔的脑组织中均检出了形态不一的肉芽肿和脑炎原虫。兔脑炎原虫可引起巨噬细胞和肉芽肿中的上皮样细胞表达TNF-α,anti-TNF-α抗体染色呈阳性反应。细胞凋亡信号转导通路的关键蛋白caspase-8和caspase-3在血管内皮细胞、星形胶质细胞和上皮样细胞中呈强阳性或阳性反应,被anti-caspase-8和anti-caspase-3抗体染成淡棕色或深棕色。对脑组织蛋白提取物进行Western blot检测,病兔脑组织中TNF-α,caspase-8和caspase-3的表达量明显高于对照兔,差异极显著(P0.01)。结果表明,兔脑炎原虫可刺激脑组织中的巨噬细胞和上皮样细胞产生大量TNF-α,后者与细胞膜上的TNFR结合,从而激活死亡受体通路,引起胞浆内的caspase家族发生级联反应,导致细胞凋亡。     

二烯丙基二硫化物诱导MDCC-MSB-1细胞的凋亡及Fas/FasL信号通路调控作用

为探究二烯丙基二硫化物(DADS)对马立克氏病肿瘤细胞系(MDCC-MSB-1细胞)的增殖抑制作用及其信号通路的调控机制,以MDCC-MSB-1细胞作为研究对象,采用CCK-8法检测不同浓度DADS分别作用MDCC-MSB-1细胞24、48、72 h后对细胞增殖抑制的影响。用0、80、160、240μmol/L DADS预处理MDCC-MSB-1细胞24 h后,光学显微镜观察细胞形态变化;Hoechst 33342核酸染色法检测细胞形态变化;caspase-8活性试剂盒检测细胞中caspase-8蛋白酶活性;并用荧光定量PCR法检测Fas/FasL信号通路关键因子mRNA的转录水平。结果显示,40μmol/L～240μmol/L的DADS抑制MDCC-MSB-1细胞的增殖呈时间剂量依赖性;随着浓度的升高,细胞形态逐渐出现细胞核核膜消失,染色体降解为多个片段并且边缘化,形成凋亡小体;240μmol/L的DADS可诱导MDCC-MSB-1细胞caspase-8蛋白酶活性及Fas、FADD、caspase-8、Bid和caspase-3 mRNA的转录水平极显著升高(P0.01)。结果表明,DADS可诱导MDCC-MSB-1细胞的凋亡,并活化其Fas/FasL死亡受体凋亡信号通路,可为鸡马立克氏病的治疗提供参考。     

猪胎盘绒毛滋养层细胞体外原代培养

本研究旨在建立一种简便有效的猪胎盘绒毛滋养层细胞体外分离纯化方法。采用胰酶DNase I酶联合消化法消化母猪自然分娩后胎盘绒毛组织,以35%、45%2个Percoll密度梯度法进行猪胎盘绒毛滋养层细胞的分离纯化,并通过观察细胞形态、测定生长曲线、免疫荧光染色、透射电镜等鉴定猪胎盘绒毛滋养层细胞。结果表明,分离培养的猪胎盘绒毛滋养层细胞呈上皮样平铺成片生长,形态为多角形或类圆形,培养48h后部分细胞开始融合成多核合胞体滋养层细胞。免疫荧光染色结果显示,细胞角蛋白7染色阳性占91%以上,表明分离获得的猪胎盘绒毛滋养层细胞纯度较高。透射电镜观察显示,所获细胞具有典型滋养层细胞结构特征。综上表明,采用胰酶DNase I酶联合消化法和35%、45%2个Percoll密度梯度法进行分离纯化,可简便有效地获得较高纯度的猪胎盘绒毛滋养层细胞。     

添加罗格列酮对小鼠卵母细胞氧化还原稳态的影响

【目的】探究在体外成熟培养基中添加罗格列酮(rosiglitazone, RSG)对小鼠卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响,为体外成熟培养系统的优化提供参考。【方法】通过在体外成熟培养基中添加0、10、20、50、100μmol/L RSG,统计第一极体(PBⅠ)排出率,确定RSG最适浓度。根据RSG最适浓度筛选结果分为对照组和罗格列酮组,通过免疫荧光染色法检测卵母细胞内活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、组织蛋白酶B(CB)、线粒体膜电位水平(MMP)及囊胚内总细胞数(Hoechst 33342)和细胞凋亡比率(TUNNEL);使用实时荧光定量PCR检测囊胚内抗氧化相关基因(Sod-2、Gpx-3和Cat)和凋亡相关基因(Caspase-3、Bcl-2和Bcl-xl)转录水平。【结果】与对照组相比,添加20μmol/L RSG可显著提高小鼠卵母细胞第一极体排出率、卵裂率及囊胚率(P<0.05);卵母细胞内ROS和CB水平均显著降低,GSH和线粒体膜电位水平均显著提高(P<0.05);囊胚内总细胞数显著提高,细胞凋亡比率显著降低(P<0.05);抗氧化相关基因(Sod...     

红色荧光示踪狂犬病病毒ERA株病毒粒子方法的建立

为建立一种狂犬病病毒(RABV)荧光标记方法,便于有效地观察研究RABV侵入细胞及脱壳的过程,本研究采用CY5-NHS酯红色荧光染料标记氨基的方法将纯化的RABV ERA株进行CY5-NHS酯荧光染料标记;采用亲脂性羰花青荧光染料将细胞膜染成绿色;采用DNA荧光染料将细胞核染成亮蓝色;在3D活细胞激光共聚焦分析成像系统下成像,动态观察病毒吸附细胞并内吞的过程。与传统的染色方法相比,本研究建立的病毒标记方法更适合在3D活细胞激光共聚焦分析成像系统下观察和拍摄RABV感染细胞的过程,为RABV感染机制的研究提供了一种有效研究方法,对于其它弹状病毒科病毒标记方法的建立也具有一定的参考意义。     

FGF4在牛早期胚胎发育过程中的表达

应用实时荧光定量PCR和免疫荧光染色技术对成纤维生长因子4(FGF4)在牛早期胚胎发育各个阶段的表达和定位规律进行研究。结果表明,FGF4mRNA及蛋白在牛MⅡ期卵母细胞及各阶段早期胚胎均有表达,其表达量由强到弱依次为桑椹胚、囊胚、8-细胞胚、MⅡ期卵母细胞、4-细胞胚、2-细胞胚;从定位来看,FGF4在MⅡ期卵母细胞及8-细胞期前的各阶段早期胚胎的细胞质和细胞核中均有表达,而8-细胞期及之后的桑椹胚和囊胚期仅分布于细胞质。结果提示,FGF4在牛的早期胚胎发育过程中可能发挥重要作用。     

维生素E提高牛孤雌胚胎的体外发育研究

体外生产的牛孤雌胚胎用添加了VE，VE＋VC的CR1aa培养液，置38．5℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中进行培养。通过荧光染料Hoechst 33342对胚泡进行荧光染色，检测孵化囊胚的总细胞数。结果表明，当培养基中添加100μmol／LVE时，与对照组相比，扩张囊胚发育率和胚泡的细胞总数显著提高（P〈0．01）；当VE与VC联用时，发育到早期囊胚、扩张囊胚、孵化囊胚的数量和胚泡的总细胞数均低于单独使用VE的培养组。