基于SELDI-TOF-MS技术的奶牛乳热血浆蛋白质组学分析

奶牛乳热是围产期奶牛营养代谢性疾病,对于奶牛乳热在病理方面少有血浆蛋白质组学的研究。本研究目的是探究奶牛乳热在蛋白质组学层面的变化。试验21头患有奶牛乳热的奶牛和59头健康奶牛作为试验动物。试验通过SELDI-TOF-MS技术检验得到24个差异肽段的峰值,其中10个肽段经过Swissport Protein数据库搜索鉴定为10种差异蛋白。结果相对于对照组,乳热组中表达上调的蛋白4个;表达下调的蛋白2个;还有既表达上调又表达下调的蛋白4个。结论本次试验应用SELDI-TOF-MS技术鉴定了几个在奶牛发生乳热时表达的差异蛋白质。这些发现也为以后揭示奶牛乳热代谢性改变提供了依据。     

奶牛乳热症发生的原因及其防治措施

奶牛乳热症（Milkfever）是成年母牛分娩后短时期内突然发生的一种营养代谢障碍疾病，以知觉消失及四肢瘫痪，血清中钙离子浓度低下为主要特征，故又称为产后瘫痪症、低血钙症。此病主要发生于产后三日内的多产、产奶量高奶牛，多发生在3—6胎。乳热症还会诱发瘤胃弛缓、皱胃变位、胎衣不下、子宫脱和子宫炎等症。     

亚临床低血钙症奶牛血液、乳汁、粪便、尿液指标特征的研究

为了探讨亚临床低血钙症奶牛血液、乳汁、粪便、尿液中相关指标的特征,试验选取亚临床低血钙症组和健康对照组奶牛各6头,通过血液、乳汁、粪便、尿液等样品中代谢相关指标的检测,阐明亚临床低血钙奶牛代谢特征。结果表明:在检测到疾病后的试验期间(试验期为4 d),血液指标中亚临床低血钙症组门冬氨酸氨基转移酶(AST)和总胆红素(TBIL)极显著高于健康对照组(P0.01),肌酐(CREA)含量显著高于健康对照组(P0.05);碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)指标含量均极显著低于健康对照组(P0.01);β-羟丁酸(BHBA)、游离脂肪酸(NEFA)均高于健康对照组,其中游离脂肪酸(NEFA)极显著高于健康对照组(P0.01),BHBA显著高于健康对照组(P0.05),葡萄糖(GLU)浓度显著低于健康对照组(P0.05);钙(Ca)、磷(P)、镁(Mg)含量均极显著低于健康对照组(P0.01)。乳汁指标中,亚临床低血钙症组乳脂率、乳蛋白、干物质均显著高于健康对照组(P0.05)。粪便指标中,亚临床低血钙症组酸性洗涤纤维显著低于健康对照组(P0.05)。尿液指标中亚临床低血钙症组镁离子含量显著低于健康对照组(P0.05),尿蛋白含量显著高于健康对照组(P0.05)。说明亚临床低血钙症奶牛试验期间表现为能量负平衡,肝功能异常,矿物质代谢紊乱,但肠道消化吸收功能正常,肾功能障碍。     

奶牛围产期血浆Ca、P、AKP和HYP的变化

为了解健康奶牛围产期钙代谢特点,本试验选取围产期健康奶牛20头,分别在产前7d、3d,分娩当天,产后3d、7d对试验奶牛血浆Ca、P、ALP、HYP浓度进行测定。按每个时间点血钙水平将试验奶牛分为血钙正常组(C)和低血钙组(L)。结果显示:奶牛在产前7d至产后7d低血钙发生率分别为45%、20%、80%、25%、15%。产前7d到产后7d,C组奶牛血浆Ca、ALP、HYP水平均显著高于L组(P0.05)。两组奶牛血浆P浓度围产期无显著差异(P0.05)。结论:奶牛围产期易发生低血钙,以分娩时发生率最高;围产期奶牛低血钙症的发生可能与骨钙动员能力低有关。     

奶牛亚临床低血钙症的蛋白质组学分析

根据奶牛血浆钙浓度将奶牛分为试验组和对照组,并设置2个平行试验组。应用iTRAQ/LC-MS/MS技术对2组奶牛样品进行差异表达蛋白的筛选和鉴定,并结合生物信息学软件对试验结果进行分析。试验共得到398个差异表达蛋白,其中2个平行试验组重叠的蛋白为265个,经过筛选共得到14种具有统计学差异的表达蛋白。结合生物信息学分析中的基因功能分析,结果得到74个注释结果,细胞组成、分子功能和生物过程分别为6,12,55个。根据结果分析可知,奶牛亚临床低血钙症生理和病理现象能够从3个方面解释其生理和病理现象,分别是血钙调节、免疫与炎症反应和血液凝固与补体途径。本试验首次应用iTRAQ结合LC-MS/MS技术对亚临床低血钙症奶牛进行蛋白质组学分析,填补该技术对亚临床低血钙症的空白,并提供科学依据。     

青贮饲料可减少奶牛乳热症

奶牛乳热症(又称生产瘫痪,ParturientParesis)是秋季产犊奶牛的常见病。大量实验证明,经产奶牛患此病,多是由乳热症(血钙水平低)引起的,而血镁水平的变化是次要的作用。英国有人做了以下的观察,秋季产犊的奶牛如果产前三周关在圈内并饲喂青贮饲料,结果仅有11％的奶牛患乳热症,而在户外放牧的奶牛发病率达35％。为了确定饲喂青贮饲料能否减少乳热症的发生,进行了以下的试验。试验比较了常规放牧与关在圈内饲养并在预产期前三周喂给青贮饲料,连续三年,每年     

IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌保护性抗原Sip亚单位疫苗的研究

为研究无乳链球菌Fc-Sip亚单位疫苗的免疫效果,并验证IgGFcRn在奶牛乳腺发生局部免疫过程中的重要作用。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达了由IgGFcRn介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白(Sip)的融合蛋白Fc-Sip,并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗。选取干奶前15 d的奶牛进行加州乳房炎检测法(CMT)检测,选取120头CMT(++)以上的奶牛进行分组免疫。通过免疫前后的细菌分离试验、牛奶体细胞数测定、免疫牛血清抗体间接ELISA检测来评价该亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前乳样细菌分菌率为86.6%,无乳链球菌检出率为46.6%;免疫后乳样分菌率降至40%,无乳链球菌检出率降至13.3%,表明Fc-Sip亚单位疫苗不但可以治疗无乳链球菌性奶牛乳房炎,还可以抑制其它奶牛乳房炎致病菌的侵入。首次免疫后60 d,免疫组80%奶牛血清抗体滴度达到1∶2 048～1∶4 096,对照组奶牛抗体滴度一直保持在1∶512。首次免疫后90 d,使用利拉伐牛奶体细胞计数仪测定实验奶牛乳样中的体细胞数,免疫组奶牛乳样体细胞数范围在0.17×10~5个/mL～3.91×10~5个/mL,对照组奶牛乳样体细胞数的范围在4.05×10~5个/mL～7.27×10~5个/mL。免疫组奶牛血清抗体滴度的升高及免疫后牛奶中体细胞数的减少,表明该亚单位疫苗促进了奶牛体液免疫反应和局部免疫反应的发生,也证明该亚单位疫苗具有降低牛奶体细胞数的作用。本研究为奶牛乳房炎无乳链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

投服博威钙对奶牛产奶性能和健康状况的影响

选择2～5胎成年泌乳母牛40头,按照年龄、胎次、分娩时间相近的原则随机分为试验组与对照组,每组20头,研究博威钙对产后奶牛产奶性能和健康状况的影响。试验组奶牛产后0h及12h分别投喂1粒博威钙,对照组采用常规补钙(通过输液,每头奶牛补氯化钙25g)。结果发现,与对照组相比,试验组奶牛平均日产奶量提高了2.05kg,体细胞数降低了37.3%(P<0.05);乳尿素氮的变化不显著(P>0.05)。在产后奶牛健康状况方面,试验组奶牛的亚临床型低血钙症、临床型低血钙症、隐性乳房炎、临床型乳房炎和胎衣不下的发病率均显著低于对照组,真胃移位、酮病以及蹄病方面的发病率则无显著变化。研究表明,补饲博威钙能够改善产后奶牛的健康状况,提高奶牛产奶性能和养殖效益。     

热应激对奶牛乳中活性蛋白的影响

试验随机选取23头泌乳中期荷斯坦奶牛,通过实时监控外界环境温湿度,计算温湿度指数,确定奶牛热应激状态,测定奶牛产奶量、乳成分和乳中活性蛋白,以研究热应激对中国荷斯坦泌乳奶牛乳中活性蛋白的影响。结果表明:与轻度热应激奶牛相比,中度热应激奶牛生产性能会极显著下降(P0.01),平均降低了20.06%;中度热应激奶牛乳脂率显著降低(P0.05),乳中尿素氮极显著升高(P0.01),体细胞数显著升高(P0.05);中度热应激奶牛乳中血清蛋白显著升高(P0.05),α-乳白蛋白极显著升高(P0.01),但乳中免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)含量并无显著差异。因此,不同程度的热应激影响泌乳中期奶牛生产性能、乳成分和乳中活性蛋白。     

氨基酸螯合钙口服液对产后奶牛健康状况及乳品质的影响

本研究旨在探讨氨基酸螯合钙口服液及复方氨基酸螯合钙口服液对产后奶牛健康状况和乳品质的影响。选取某大型牧场产后奶牛,按照分娩顺序交替指定为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,对照组饲喂常规日粮,试验Ⅰ组灌服氨基酸螯合钙口服液,试验Ⅱ组灌服复方氨基酸螯合钙口服液,定时采集血样和乳样,用于分析血浆生化指标及乳品质,同时观察产后奶牛的健康状况。结果表明:与对照组相比,试验Ⅰ组产后奶牛血浆钙含量及乳汁中乳蛋白含量升高,血浆甲状旁腺素含量、亚临床型低钙血症、胎衣不下的发病率显著降低;试验Ⅱ组产后奶牛血浆钙、镁含量和乳汁中乳蛋白含量升高,亚临床型低钙血症、胎衣不下的发病率及乳汁中体细胞数显著降低,在产后第7天极显著提高血浆中降钙素含量,极显著降低低镁血症的发病率。结果提示,氨基酸螯合钙口服液及其复方口服液,对控制奶牛产后疾病、提高乳品质量具有较好的效果,且复方口服液的效果更理想。     

奶牛低血钙早期预警指标的确立与评估

为了早期预测奶牛分娩时发生低血钙症的可能性,本试验在黑龙江省A和B两个集约化牛场(均有250多头泌乳牛)随机选取产前15~2d和分娩当天奶牛作为实验动物。通过检测试验奶牛分娩当天组血浆钙浓度,明确分娩奶牛低血钙症发病率;通过检测试验奶牛产前和分娩当天血浆中镁离子(Mg2+)、钾离子(K+)和无机磷(P3+)的浓度,阐明奶牛产前血浆中各离子水平与低血钙症的关系,对产后低血钙症发生风险起到预警作用。结果显示:产后低血钙症在牧场A的发病率为90.32%,在牧场B为86.67%;两牧场产前奶牛与分娩当天奶牛的血浆P3+、K+、Mg2+差异极显著,血浆P3+、Mg2+水平与血钙水平呈显著的正相关,血浆K+水平与血钙水平并没有显著的相关性。根据受试牛工作特征曲线(ROC)分析确定了牧场A产前预警值为血浆Ca2+2.11mmol/L,敏感度为100%,特异度为88.2%;血浆P3+1.83 mmol/L,敏感度为75.0%,特异度为82.4%。牧场B产前预警值为血浆Ca2+2.12mmol/L,敏感度为98.7%,特异度为88.5%;血浆P3+1.90 mmol/L,敏感度为98.7%,特异度为65.4%。结论:奶牛产前血浆Ca2+和P3+浓度超过预警值可作为奶牛产后低血钙发生的早期风险预测依据。     

奶牛围产期低血钙发生状况及其调节作用

为了解奶牛围产期低血钙发生状况及其调节作用,本试验选取围产期经产的健康奶牛20头,分别对其产前21d、14d、7d、产后7d、14d、21d及分娩当天血中钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、羟脯氨酸(HYP)、甲状旁腺素(PTH)、骨钙素(BGP)、降钙素(CT)浓度进行测定.按血钙水平将试验奶牛按上述时间点均分为对照组(血钙正常)和低血钙组.结果显示:奶牛在产前21d至产后21d低血钙发生率分别为:0%、45%、20%、80%、25%、15%、10%.对照组奶牛血浆Ca、BGP的浓度产前14d到产后21d显著高于低血钙组(P<0.05),ALP、HYP在产前7d到产后21d显著高于低血钙组(P<0.05).两组奶牛血浆P浓度在围产期无显著差异(P>0.05).对照组血浆CT浓度在产前7d和分娩当天显著低于低血钙组(P<0.05),其他时间点差异不显著(P>0.05);对照组血浆PTH浓度在产前7d到产后21d时显著低于低血钙组(P<0.05).结论:奶牛围产期易发生低血钙,以分娩时发生率最高.奶牛围产期易发低血钙与钙代谢调节激素未能发挥其动员骨钙的调节作用有关.     

阴离子盐预防奶牛低血钙症的机理及应用

低血钙症是经产奶牛干奶过渡期非常容易出现的代谢性疾病.这不但会严重影响奶牛的健康和经济效益,而且患有低血钙症的奶牛还常常伴有其他产后疾病.因此,预防低血钙症具有重大的意义.实际生产中,在干奶过渡期的奶牛日粮中添加阴离子盐,使日粮阴阳离子差(DCAD)达到-100～-150毫当量,同时每天为奶牛提供120～150 g钙,定期监测尿液pH和采食量,能够避免低血钙症的出现.     

治愈16例奶牛酒精阳性乳

奶牛酒精阳性乳(奶牛酸奶症),在临床上虽不属多发病,但时有发生,一旦发生会给养牛户造成很大经济损失。1临床资料介绍一饲养100多头奶牛的牛场,有16头奶牛产酒精阳性乳。其中有6例发生在产后1个月内,乳房外观无异常变化,乳房炎试验检查为(-)性,但榨乳后马上以酒精试验检查乳汁呈絮状。这种类型酒精阳性乳,为代谢型奶牛酸奶症。有8例发病在泌乳期内,无规律性变化,多数在旺奶期,个别的发生在旺奶期之后。乳房无热、痛,无形态学上的改变,试验室隐性乳房炎检查为( )性,为隐性乳房炎型酒精阳性乳(酸奶症)。其他2例是在旺奶期营养良好的高产奶牛,…     

奶牛乳房炎无乳链球菌Fc-Sip和金黄色葡萄球菌Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗的免疫试验研究

为探究由IgG FcRn介导奶牛乳房炎无乳链球菌(S. agalactiae,Sgc)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,Sau)保护性抗原亚单位疫苗的免疫效果,在本实验室前期研究基础上,本研究按体积11的比例将Sgc的Fc-Sip和Sau的Fc-FnBPB-ClfA两种蛋白分别与1%的盐酸左旋咪唑(1%LH)充分混合,制备两种亚单位疫苗。将即将干奶(妊娠220 d)、CMT试验为"++"以上的奶牛随机分为4组,分别将Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗(A组)、Fc-Sip亚单位疫苗(B组)、Fc-FnBPB-ClfA亚单位疫苗(C组)通过首次肌肉免疫和二次乳头管灌注免疫方式进行免疫试验。通过免疫前后对乳样细菌分离、体细胞数测定及免疫血清抗体滴度测定,评价上述亚单位疫苗的免疫效果。结果显示,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛的乳样细菌分离率分别为80%、90%、80%,其中Sgc检出率分别为20%、30%、10%,Sau检出率分别为30%、20%、10%;首免90 d后3个免疫组奶牛乳样细菌分离率分别降至20%、20%、40%,其中Sgc的检出率分别降至0、0、10%,Sau的检出率分别降至10%、10%、0,对照组免疫前后以上各项检测无明显变化。使用利拉伐牛奶体细胞检测仪检测免疫前后试验奶牛乳样中的体细胞数,免疫前免疫组(A、B、C)奶牛体细胞数均值分别为6.19×105个/mL、5.16×105个/mL、5.49×105个/mL,首免90 d后3个免疫组奶牛乳样中体细胞数均值分别为2.05×105个/mL、2.04×105个/mL、2. 52×105个/mL,而对照组奶牛乳样体细胞数与免疫前无明显变化。检测首免后0、7 d、14 d、28 d、60 d、90 d的血清抗体滴度,结果显示,首免后7 d,免疫组(A、B、C)80%的奶牛血清抗体滴度为11 024;第14 d后,免疫组(A、B、C)90%奶牛血清抗体滴度达到12 048;第28 d后,免疫组(A、B、C)80%奶牛血清抗体滴度在14 096～18 192,比对照组平均上升3～4个抗体滴度,对照组奶牛血清抗体滴度一直保持在1256～1512。综合分析以上试验结果显示免疫A组(Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA)综合免疫效果在各免疫组中最佳。本研究结果表明Fc-Sip+Fc-FnBPB-ClfA二联亚单位疫苗对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎具有较好的治疗和预防作用,为奶牛隐形乳房炎的防治提供了实验依据。     

镁与乳热症

已知乳热症的发生与母牛血浆矿物质组分的严重改变有联系。引起此病临床症候的最重要变化是钙浓度急剧下降。然而,钙浓度下降几乎都同时伴有磷浓度大量下降,而镁浓度变化较小,并且没有什么恒定的变化,最常见的是镁浓度略微升高,但有时则降低。术文是报告有关这些生化与乳热症发病率关系的研究,并提出亚临床低血镁症在乳热症的病因学中可能是很重要的。本文还指出肥胖母牛综合症与乳热症的发生有联系,这种联系可能是通过脂肪代谢影响血浆镁浓度而发挥作用。     

血浆对氧磷酶1在奶牛酮病中的变化及其预测作用

为了早期预测奶牛酮病的发生,随机选取黑龙江某集约化牛场,产后14~21 d奶牛为试验动物。通过对氧磷酶1(PON1)、葡萄糖(GLU)、游离脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和谷草转氨酶(AST)的检测,阐明奶牛围产期PON1在奶牛酮病发生风险的预警作用。结果表明,酮病组较对照组奶牛血浆中PON1活性和含量显著下降。PON1含量、活性与GLU、BHBA、NEFA和AST均有显著相关性。根据受试者工作特征曲线(ROC)分析确定酮病预测值为血浆PON1含量46.79 nmol/L、GLU3.04 mmol/L、AST100 U/L、NEFA0.82 mmol/L。试验表明,PON1、GLU、AST和NEFA均可用作预测奶牛酮病发生风险的评估指标。     

甲酸钙和乳酸钙对泌乳奶牛生产性能、乳成分、血液生化指标及钙磷代谢的影响

本试验旨在研究甲酸钙和乳酸钙对泌乳奶牛生产性能、乳成分、血液生化指标及钙磷代谢的影响。选取产奶量、胎次、乳成分和泌乳天数相近的健康荷斯坦泌乳奶牛45头,随机分为3组,每组15个重复,每个重复1头牛。对照组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组分别以甲酸钙和甲酸钙+乳酸钙替代基础饲粮中50%的石粉,并使3组饲粮中钙水平一致。预试期10 d,正试期60 d。结果表明:1)与对照组相比,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组乳蛋白率显著提高(P0.05);乳钙含量和乳脂率均有所升高,但差异不显著(P0.05)。各组之间干物质采食量、产奶量、乳糖率、乳磷含量均无显著差异(P0.05)。2)试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的血浆骨钙素(OC)含量均显著高于对照组(P0.05)。各组之间血清中钙、磷、甲状旁腺激素(PTH)含量及碱性磷酸酶(ALP)活性,血浆中骨吸收标志物(CTX)含量均无显著差异(P0.05)。3)试验Ⅰ组与试验Ⅱ组钙、磷表观消化率显著高于对照组(P0.05),钙、磷平衡显著高于对照组(P0.05),粪钙、粪磷含量显著低于对照组(P0.05)。综上所述,在奶牛饲粮中用甲酸钙和乳酸钙替换部分石粉,显著提高了泌乳奶牛乳蛋白率,对乳脂率和乳钙含量也有提升作用,显著提高了钙、磷表观消化率,减少了钙、磷排放量。     

围产期奶牛低钙血症发病机制研究进展

正随着奶牛养殖业集约化程度的不断提升以及奶产量的增加,围产期奶牛低钙血症和产乳热的发生率不断升高,已成为围产期高产奶牛最高发疾病之一,尤其是生产瘫痪病牛淘汰率极高,如不及时治疗,并能继发其他产科疾病。因此,防治围产期奶牛低钙血症和产乳热也越来越受到重视。由于该病的发病原因复杂,影响因素众多,发病机制尚不十分清楚。本文将对奶牛低钙血症发病机制(图1)加以综述,旨在对临床实践中有效防治该病提供参考。1 围产期奶牛低钙血症/产乳热症的发     

不同物种乳氨基酸含量及组分的比较研究

为探讨不同物种乳氨基酸含量的差异及变化规律,本试验分别从北京、陕西、云南和青海等地区采集奶牛(高蛋白奶牛和低蛋白奶牛)、山羊、水牛和牦牛的乳样(各20个样品),乳样品经7.8 mol/L盐酸水解24 h后,采用氨基酸自动分析仪测定其中17种氨基酸含量,采用SAS 9.0和The Unscrambler 9.8软件分别对数据进行方差分析和主成分分析(PCA)。方差分析结果表明,牦牛乳中17种氨基酸含量均显著高于水牛乳、山羊乳、高蛋白奶牛乳和低蛋白奶牛乳(P<0.05);水牛乳中除苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸和酪氨酸外,均显著高于山羊乳、高蛋白奶牛乳和低蛋白奶牛乳(P<0.05);山羊乳中苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量均显著高于奶牛乳(P<0.05);除蛋氨酸外,高蛋白奶牛乳中氨基酸含量均显著高于低蛋白奶牛乳(P<0.05),4物种乳中总氨基酸含量均差异显著(P<0.05);PCA结果表明,水牛乳、牦牛乳、奶牛乳中氨基酸组成及含量相似,而山羊乳中由于较高含量的丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和酪氨酸使得其与水牛乳、牦牛乳、奶牛乳明显区分开。提示,不同物种乳中氨基酸含量差异显著,且具有一定的种属特性。