禽伤寒沙门氏菌SG9R株asd基因缺失株平衡致死系统平台的构建

为研发以禽伤寒沙门氏菌(SG)SG9R弱毒疫苗株为载体表达外源基因的活菌疫苗,本研究利用Red同源重组系统对SG9R株基因组中编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因进行敲除,构建SG9R△asd缺失突变株。该突变株在缺乏外源DAP培养条件下溶菌死亡,而在添加DAP或导入表达链球菌asd+质粒p YA3342后才能够恢复增殖能力,以此建立了以asd营养基因为筛选标志的SG染色体-质粒平衡致死系统。并且进一步采用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,将其克隆于asd+质粒p YA3342中,电转化于SG9R△asd缺失突变株中,通过无DAP培养条件的筛选,获得了表达GFP外源基因的SG重组菌,经体外连续25次传代后,鉴定结果显示,GFP仍能够在重组SG中持续稳定的表达。本研究结果为以SG弱毒疫苗菌株作为活载体的基因工程疫苗的研制提供简便易行的操作平台。     

利用Z染色体培育家蚕的平衡致死系统

一、前言为实现雄蚕育,田岛(1951)和Strunikov(1969)等选育出了限性黑卵,但这些系统要有待别的选卵装置。Strunikov(1979)又利用Z染色体的平衡致死选育出雄蚕全部致死的系统。大沼,田岛(1983)首先利用包括第5染色体在内的性染色体转座系统(鬼丸、田岛,1983)进行由卵色基因识别雌雄的平衡致死系统的培育,选育出雌蚕全部致死,只有雄蚕能孵化的系统。但在实际应用中总存在非用T(W;S)5     

减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

家蚕平衡致死系的研究

家蚕平衡致死系的研究徐安英，李木旺，费美华，黄君霆（中国农业科学院蚕业研究所）家蚕雄蚕体质强健，饲料效率高，雄蚕茧出丝率比雌蚕高２０％，而养蚕生产上所用蚕品种一般是雌雄比各占５０％，如果光养雄蚕可以在不增加成本的条件下，多产丝１５％，并且，雄蚕丝质好...     

家蚕性连锁平衡致死系雌性胚胎的组织形态学初步研究

为了调查家蚕性连锁平衡致死系中Z染色体携带致死基因l2的雌性胚子(简称l2胚子)致死的时间和原因,收集家蚕性连锁平衡致死系品种平2不同胚胎发育时期的雌性黑卵,解剖获取胚胎后用光学显微镜对不同发育时期的l2胚子进行组织形态学观察。形态观察可见l2胚子在胚胎发育早期和能正常发育的雌性胚子没有区别,但l2胚子发育至晚期的己2期,约有一半胚子的体表未能正常着色,因此推断那些仍没有正常着色的胚子即为致死的l2胚子。通过胚胎的半薄切片观察发现,己2期l2胚子的组织器官结构完整,与正常发育的雌性胚子之间无明显的差异。观察结果提示:l2胚子死亡可能不是由于胚胎组织结构异常造成的,有可能是在己2期胚子停滞发育致死。     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段(P97CR1)作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段（P97CR1）作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

三眠蚕SG×54A的性状

SG×54A是中国农科院蚕业研究所育成的"九五"攻关课题96～616～02～01完成的品种之一,2000年通过国家重点科技攻关计划验收.结果表明:各项经济性状达到国家考核的技术经济指标任务,茧丝纤度1.87～2.20dtex,解舒丝长900～1000m,净度94～95分,综合性状达到实用水平.该品种是根据家蚕眠性遗传原理,利用家蚕遗传资源中的眠性稳定、经济性状较差的显性三眠蚕品种和经济性状优良的实用四眠蚕品种作亲本,采用杂交育种和系统选育等手段选育出了经济性状优良、眠性稳定的显性三眠品种"SG".     

减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

为研制能够稳定携带外源基因的猪霍乱沙门菌口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△cyaC78-1基础上,利用自杀性质粒介导的等位交换技术,构建了△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统,并对其生物学特性进行了鉴定。PCR及测序结果表明△cya△asdC78-1构建正确,其生物学特性检测结果显示△cya△asdC78-1生化特性与△cyaC78-1完全相同,血清型与△cyaC78-1和疫苗株C500相同,并且具有稳定的遗传特性;其生长速度与△cya C78-1基本相同,均明显慢于疫苗株C500。动物试验表明△cya△asdC78-1电转化携带asd基因的互补质粒pYA3493后,其毒力比△crp△asdC78-1(p YA3493)降低1.14倍,比△asdC500(pYA3493)降低了5.1倍。以上结果表明,减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1同样可以作为口服活疫苗载体用于高效表达外源基因,为开发以C78-1为基础的口服多价疫苗载体奠定了基础。     

新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鸡白痢沙门菌口服活疫苗载体。本研究以pcDNA3.1-Zeo(+)质粒为基础,用沙门菌asd基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建不含抗性基因的真核互补质粒pcD-asd;再将互补质粒pcD-asd电转入沙门菌ΔcrpΔasdC79-13,构建ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因EGFP克隆入pcD-asd,构建重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-EGFP),感染鸡胚成纤维(CEF)细胞,Western blot分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢,对氨苄抗生素敏感;重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)的LD50较野生株C79-13降低了3.4×104倍;Western blot结果发现,重组菌株感染CEF细胞后,可表达大小约为27 000EGFP蛋白。以上结果证实,本研究成功构建了新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)株,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

绿脓杆菌致死鹅胚的初步研究

安徽某孵房在鹅胚孵化至25日龄时,鹅胚出现死亡;至28日龄,该批鹅胚全部死亡。对送诊的死亡鹅胚进行病原分离与鉴定,结果表明本次鹅胚死亡的原因是由绿脓杆菌感染引起。     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd⁺的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

三眠品种SG×54A的农村饲养

三眠蚕品种首次在江苏省海安农村试养推广,为开发细纤度茧丝提供了新原料。本文介绍了品种性状、饲育要点及注意事项。     

利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。     

柞蚕红蚕致死基因的初步研究

河南柞蚕地方品种中,往往出现个别红色蚕,称谓红蚕。从1954年群众选择培育始,至今已有十年的历史了。从选育成绩来看,红蚕不仅具有生命力强的特性,而且茧质也好,因此我们认为是一个优良的选育类型。但在选育过程中,虽历代汰黄存红,然每代皆分离红、黄二色蚕,似无固定的个体,因而对于稳定该类型带来困难。为了尽快稳定其类型,查究分离的原因,是当前迫切解决的问题。     

鸡痘病毒通用高效表达载体的构建及其初步应用

利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后将 FPV早晚期启动子 PE/ L 及其启动的鹅源新城疫病毒 NDV ZJ1株的 F基因一并插入 p N1 1 S中 ,使PE/ L 与 Ps反向串联 ,从而构建出 1个含 NDV ZJ1株 F基因的重组 FPV高效双表达载体 p N1 1 SEF,其 MCS可以用于插入其他外源基因。在此基础上 ,将 NDV ZJ1株的 HN基因插入 p N1 1 SEF的 Ps启动子下游的 MCS中 ,构建了共表达 NDV ZJ1株 F和 HN基因的重组 FPV双表达载体 p N1 1 SEFHN。将 p H1 1 SEFHN质粒 DNA与 FPV2 82 E4株共转染 CEF,得到共表达 NDV ZJ1株和 HN基因的重组 FPV,间接免疫荧光实验初步证明外源基因得到了较好的表达。表明所构建的通用高效 FPV表达载体有利于高效基因工程活载体疫苗的研制 ,具有广阔的应用前景     

氨基酸平衡的重要性及其应用

在家畜饲养中,不仅要求日粮中有一定的蛋白质数量,而且更要求有一定的质量。蛋白质的质量取决于必需氨基酸的含量及其平衡情况。如果日粮中缺乏某一种或几种必需氨基酸,特别是赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸等,就能使畜禽生长停滞,甚至体重下降,并且还会影响整个日粮的利用率。反之,若     

F18大肠杆菌黏附素在染色体-质粒平衡致死系统中的表达

将含有启动子及核糖体结合位点RBS的E.coliK12菌株源asd基因克隆入表达质粒载体pnirBMisL-fedF中,构建重组表达质粒pMisL-fedF-asd,使该质粒中氨苄抗性基因失活的同时能表达fedF和asd基因。该重组质粒pMisL-fedF-asd转化E.coliDH5α宿主菌asd基因缺失株即DH5α△asd菌株后,表达F18E.coli黏附素的DH5α△asd重组菌能在不含DAP的LB平板生长,构成非抗性平衡致死系统。厌氧条件下诱导培养后,经玻板凝集反应、间接免疫荧光试验及易感仔猪小肠上皮细胞黏附试验表明,F18E.coli黏附素在DH5α△asd菌体表面得到了功能性展呈。经20次传代培养没有发现质粒丢失,F18E.coli黏附素在该系统中持续稳定表达。该染色体-质粒平衡致死系统的成功构建为研究F18E.coli黏附素亚单位疫苗在动物体内的免疫效果提供了一个安全有效的操作平台。