细粒棘球绦虫TSP33基因的克隆、生物信息学及表达分析

旨在分析细粒棘球绦虫TSP33基因的结构及其在细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达情况,预测其作为细粒棘球绦虫诊断抗原的潜在价值。从GenBank中获得Eg-TSP33的cDNA序列并设计特异性引物,提取原头蚴总RNA,反转录cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆到大肠埃希菌中,测序并进行生物信息学分析。TSP33cDNA全长864bp,编码277个氨基酸,Eg-TSP33的预测分子质量为32.11ku,预测等电点为8.62。RT-PCR结果显示,Eg-TSP33在细粒棘球绦虫成虫、包囊壁及原头蚴中均有表达,且在包囊壁中表达量较多。结果说明,Eg-TSP33可能在细粒棘球绦虫发育过程中可能具有重要作用,为Eg-TSP33分子的诊断价值研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫nanos基因的分子克隆及序列分析

为了研究细粒棘球绦虫nanos基因的序列及结构并为疫苗及新的药物研制提供靶标,试验采用注释并克隆细粒棘球绦虫nanos基因的方法,并对其序列结构进行分析;利用在线生物信息学软件分析细粒棘球绦虫nanos基因的序列结构及与其他虫属的进化关系。结果表明:细粒棘球绦虫nanos基因ORF为687 bp,编码228个氨基酸,理论分子质量为58 090.6 u,等电位点为5.08;细粒棘球绦虫NANOS蛋白由3个α螺旋和4个β片层组成;发现共有1个丝氨酸位点,1个苏氨酸位点,2个酪氨酸位点,可能的磷酸化位点是7,8,13,18,19,23位。说明该基因可能在细粒棘球绦虫生殖细胞发育过程中发挥着重要作用。     

细粒棘球绦虫TPx基因的克隆及序列分析

从自然感染病羊肝内收集细粒棘球绦虫（Eg）原头蚴,分别提取总RNA和基因组DNA。根据GenBank数据库中的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因序列设计1对引物,以总RNA为模板,采用RT—PCR技术扩增出EgTPx基因片段,同时以基因组DNA为模板扩增出对应的基因组序列。PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5口后,进行序列测定和生物信息学分析。结果表明,成功扩增到中国青海株细粒棘球绦虫EgTPx基因片段,其开放阅读框为582bp,编码193个氨基酸,与已知的EgTPx基因核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的同源性均为99％,有3个碱基发生变异,分别在245,306,318位由C变为T;引起1个氨基酸变异,由Ala^82变为Val^82。EgTPx具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点Cys^48和Cys^169。,以及周围保守的FVCP和VCPA序列。EgTPx基因的开放阅读框对应的基因组序列包含2个外显子和1个69bp的内含子。     

细粒棘球绦虫泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析

本研究对细粒棘球绦虫泛素结合酶(EgE2s)基因家族进行鉴定、生物信息学分析以及检测其在不同发育阶段的转录水平,为其功能研究和构建优势抗原表位疫苗奠定基础。本研究基于数据库中细粒棘球绦虫基因组学信息,对EgE2s基因家族进行T-A克隆、生物信息学分析以及采用qRT-PCR法检测了这些基因在原头蚴(Protoscolex, PSCs)和28日龄童虫中的转录水平。结果成功克隆并测序19个EgE2s基因,更正了两个原序列有误的EgE2s,分别为EgE2L3(登录号：MZ277618);EgE2J1(登录号：MZ277619)。三级结构和保守基序预测结果表明EgE2s高度保守。qRT-PCR结果显示,EgE2s的转录水平在PSCs和28日龄童虫中存在差异,其中EgE2A(P<0.001)、EgE2J1(P<0.01)在PSCs阶段高表达。B细胞抗原表位预测表明EgE2N的139-157区域位于EgE2s保守基序外。同时,T细胞抗原表位预测表明EgE2N与人和犬MHCⅠ类分子各有两个强结合位点,且有一个共同的抗原表位位点104-113。综上,EgE2A和EgE2J1可能在PSCs的生...     

细粒棘球绦虫TSP8基因在其不同发育阶段的差异表达及生物信息学分析

为研究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)TSP8基因的分子特性以及其在虫体不同发育阶段的差异表达,根据NCBI GenBank数据库中的TSP8基因设计1对特异性引物,对TSP8基因进行PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8基因的结构与功能,并通过SYBR Green Ⅰ qRT-PCR方法分析TSP8基因在虫体原头蚴、包囊壁以及成虫mRNA相对转录情况。结果显示：成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因序列,与细粒棘球绦虫跨膜蛋白(GenBank登录号：CDS17460.1)同源性为100%;进一步生物信息学分析显示,TSP8基因全长669个核苷酸,编码222个氨基酸,理论等电点为5.06,为稳定蛋白分子;TSP8基因编码的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,含有4个优势B抗原表位;qRT-PCR结果显示TSP8基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球绦虫TSP8基因的分子特性进行了初步研究,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。     

细粒棘球绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的表达与特征分析

旨在探讨Eg-SOD基因的特征及其在细粒棘球绦虫上的抗氧化作用。通过原核表达得到重组Eg-SOD,对其进行酶活性测定、免疫印迹、ELISA以及免疫荧光定位分析。经原核表达出的重组Eg-SOD蛋白为可溶性蛋白,以羟胺法测定其酶学活性,可达(464.55±19.99)U·mg-1。免疫印迹结果显示,该蛋白质能够被实验室人工感染细粒棘球蚴的小鼠阳性血清所识别,具有较强的反应原性;ELISA分析显示,重组Eg-SOD对人工感染细粒棘球蚴的小鼠血清和自然感染包虫病的绵羊血清检出率均为100%,而对细颈囊尾蚴的交叉反应为37.5%,提示该蛋白质可以作为潜在的诊断候选分子。免疫荧光定位显示该蛋白质广泛分布于成虫和原头蚴的组织间隙,以及少量分布于表皮。本研究对Eg-SOD的特点进行了初步的探讨,并揭示该蛋白质与虫体的抗氧化损伤有着密切的联系。     

细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆、表达及诊断价值的初步评价

探究细粒棘球绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基本特性并初步评价其诊断价值,旨在为细粒棘球绦虫的防控提供依据。本研究原核表达出Eg-cystatin重组蛋白并对其进行生物信息学、免疫印迹分析,用荧光免疫定位的方法检测该蛋白质的分布情况,并以绵羊细粒棘球蚴阳性血清评价Eg-cystatin重组蛋白的诊断价值。结果如下:Eg-cystatin生物信息学分析结果显示,该蛋白质含有一个N端信号肽以及cystatin结构域,是典型的2型半胱氨酸蛋白酶抑制剂,进化树分析显示Eg-cystatin属于绦虫cystatinⅡ型,并且与其他绦虫的cystatin相似性为72.20%~80.66%,免疫荧光定位发现该蛋白质主要分布在原头蚴的表皮和顶突钩,生发层,成虫虫体内部和虫卵。基于Eg-cystatin建立的间接ELISA方法的特异性为79.1%,敏感性为83.3%,与剖检符合率为81.25%。Eg-cystatin在成虫和幼虫时期均有表达,提示该基因与虫体生命活动息息相关,但Eg-cystatin蛋白不适合作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原候选。     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT—PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA，并亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上，转化至大肠埃希氏菌BL21，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明，从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA，序列长度为481bp，包括471bp的开放阅读框，与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致；SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒产生了约42ku的目的带，其中EG95蛋白质的分子质量约为15．2ku，与预期结果一致；Western-blotting试验检测表明，融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示，EG95基因高度保守，所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

我国三省区细粒棘球绦虫基因的变异分析

对从青海省、甘肃省和新疆维吾尔族自治区采集的24株细粒棘球蚴，用线粒体DNA的CO1基因和ND1基因结合rDNA的ITS2测序，调查了不同地区分离株基因型的变异情况。结果显示，所有分离株均为普通羊株(G1基因型)；CO1基因序列的变异率为0～0．8％，ND1基因的变异率为0．1％～0．7％；青海分离株ITS2序列的变异率为0．4％～3．1％；2株青海省西宁市和1株甘肃省武威市分离株分剐在C01基因和ND1基因序列不同位点发生的1处核苷酸非同义替换，导致1个编码的氨基酸替代。研究表明，我国上述3省、区部分区域存在的细粒棘球蚴属于同一株(G1基因型)。     

细粒棘球绦虫感染宿主免疫应答特征

棘球蚴病(包虫病)不仅影响畜牧业发展,也严重危害群众健康,导致贫病交加,阻碍农牧民脱贫致富,影响疫区经济发展和社会稳定。本文重点从细粒棘球绦虫原头节感染对小鼠免疫细胞功能的影响以及成虫的排泄分泌物对免疫细胞的调节作用两方面介绍细粒棘球绦虫感染宿主的免疫应答特征,为该病的防治研究提供了重要的科学依据和分子基础。     

细粒棘球绦虫免疫相关抗原基因的筛选及原核表达

为了筛选获得细粒棘球绦虫的免疫相关抗原基因,试验采用SEREX技术对细粒棘球绦虫cDNA文库进行相关抗原筛选,并对获得的细粒棘球绦虫特异性基因进行原核表达与鉴定。结果表明:共获得149个阳性噬菌斑,对其进行PCR扩增和序列分析得到与棘球绦虫属相关的基因序列10个,其中有864 bp的开放性阅读框序列;编码288个氨基酸;经NCBI BLAST氨基酸同源性分析,与多房棘球绦虫诊断抗原gp50的氨基酸序列的同源性为92%,是一个未知的新基因,命名为Ediag A864;经原核表达得到大小约为51 ku的重组蛋白,经Western-blot分析具有良好的反应原性。     

细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆

为筛选细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究.以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析.ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Westem blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原.筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1～2kb之间.对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%.筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因.     

细粒棘球绦虫Eg95-5蛋白生物信息学分析及鉴定

为了制备一定纯度和浓度细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus, Eg)Eg95-5蛋白,进一步开发新型疫苗和建立新的疾病诊断方法,试验采用生物信息学分析、pMD19-T-Eg95-5与pET30a-Eg95-5载体的构建、Eg95-5蛋白诱导表达及纯化、免疫印迹技术(Western-blot)对Eg95-5蛋白序列和反应原性进行研究。结果表明:Eg95-5蛋白无信号肽和跨膜结构,蛋白含有6个抗原决定簇和12个磷酸化位点,二级结构以无规则卷曲(39.25%)、延伸链(33.64%)和α-螺旋(21.50%)为主,并获得了Eg95-5的三级结构模型;成功克隆并构建Eg95-5重组表达载体,获得了高纯度的Eg95-5蛋白,该蛋白可与患病动物血清发生特异性反应。说明Eg95-5蛋白结构较为保守,是无信号肽和非跨膜蛋白,作为抗原可以引起良好的免疫反应。     

细粒棘球绦虫EgM123基因的原核表达与免疫原性检测

为了验证EgM123表达蛋白的免疫原性功能,建立犬细粒棘球绦虫EgM123基因的原核表达和蛋白纯化体系,为EgM123蛋白单克隆抗体制备与基因重组疫苗的研制提供研究基础。本试验通过构建EgM123基因原核蛋白表达载体及其蛋白表达条件优化、利用亲和层析方法对表达蛋白进行纯化、SDS-PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳）和Western blotting（蛋白质印迹）试验对表达蛋白的分子量和免疫原性进行检测,并通过间接酶联免疫吸附（ELISA）方法对所表达的EgM123蛋白的抗原功能进行验证。本试验通过菌液聚合酶链式反应（PCR）扩增和双酶切验证成功构建EgM123基因原核蛋白表达载体;优化出最佳诱导条件为37℃、表达时间为7h下表达量最高;Western blotting显示其在28KDa处均有特异性条带;ELISA显示纯化后的蛋白能很好的与EgM123多克隆抗体结合。上述结果表明EgM123表达蛋白极具免疫原性,可用于免疫BALB/c小鼠制备EgM123单克隆抗体。     

细粒棘球绦虫原头蚴lncRNA表达谱分析

本研究旨在解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴lncRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,首次从细粒棘球绦虫原头蚴中鉴定出609个新的lncRNA分子。其中intergenic lncRNA有431个,intronic lncRNA有11个,anti-sense lncRNA有68个,sence lncRNA有99个。GO分析表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与MAP激酶的负调控、SMC结合复合物、IMP的生物合成以及乙酰转移酶激活剂活性相关。KEGG分析结果表明,其表达量前200的lncRNA分子主要与细胞凋亡、萜类骨架生物合成、碳代谢以及背腹轴形成相关。cis分析结果表明,在这609个新的lncRNA分子中,与虫体Wnt信号通路、Hedgehog信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、Notch信号通路、胆酸盐信号通路以及背腹轴信号通路相关的lncRNA分子分别有79、31、10、128、43、84和73个。qRT-PCR的验证结果表明,表达量前10的lncRNA分子与测序结果一致。RNA荧光探针原位杂交结果表明,高表达的lncRNA分子在细粒棘球绦虫原头蚴吸盘以及表皮均有表达。综上所述,本研究首次解析了细粒棘球绦虫原头蚴中lncRNA的表达谱特性,丰富了细粒棘球绦虫lncRNA的数据,为进一步解析lncRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫原头蚴microRNA表达谱分析

旨在解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴中的表达谱特性,为进一步揭示miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用及调控机制提供理论依据。从患病绵羊肝无菌采集细粒棘球绦虫原头蚴,提取总RNA,构建原头蚴miRNA文库,利用RNA sequencing技术进行测序分析。结果表明,本研究从细粒棘球绦虫原头蚴中分离得到109个已知的miRNA分子,同时得到189个新的miRNA发夹前体分子。靶基因的预测结果显示,已知miRNA共有132个靶基因,而新发现的miRNA共有3 152个靶基因。进一步的研究发现这些miRNA分子广泛参与虫体生长发育相关的关键信号通路,诸如wnt、cAMP、Hedgehog、NF-κB、Notch以及胆酸盐等信号通路,研究又进一步采用实时荧光定量PCR以及原位杂交技术对虫体经典wnt信号通路相关的miRNA分子以及其靶标基因进行了差异表达以及组织定位研究。结果提示,HG328413.1_36258和β-catenin、HG328414.1_36364*和dis以及HG328399.1_25846和axin可能存在潜在的调控关系。综上所述,本研究在细粒棘球绦虫原头蚴中发现了大量的新的miRNA分子,丰富了原头蚴miRNA的数据,为进一步解析miRNA在细粒棘球绦虫原头蚴发育中的作用奠定了基础。     

细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达谱分析

旨在探索细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达特性,揭示在此发育阶段虫体主要的功能蛋白以及信号通路,为揭示虫体的发育调控、筛选疫苗以及药物靶标奠定基础。本试验采用LC-MS/MS技术对虫体原头蚴表达的蛋白质进行研究,然后对获得数据进行GO、KOG以及KEGG等分析;最后采用qRT-PCR和原位杂交技术对鉴定得到的Wnt信号通路的关键基因β-catenin进行了差异表达和组织定位研究。结果显示,本研究共鉴定得到7 172个肽段,1 197个蛋白质,其中包括多个潜在的抗原蛋白质,如四跨膜蛋白超家族、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、表皮抗原蛋白和烯醇酶等。信号通路分析结果显示其中632个蛋白参与276个调控通路,诸如与虫体发育紧密相关的Wnt、Notch、Hedgehog、NF-κB、cAMP以及胆酸盐信号通路。对β-catenin的验证结果显示,此基因分布于细粒棘球绦虫原头蚴顶突的小刺以及散在的细胞中,同时其相对转录量在体外培养0~10d的过程中呈递减趋势。综上,本研究解析了细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质表达元件,揭示了原头蚴主要的调控信号通路,为虫体的生长发育机制以及包虫病的有效防控提供了理论依据。     

细粒棘球绦虫BAG3和EB1基因的克隆、表达及其在原头蚴细胞凋亡中的作用

旨在探究细粒棘球绦虫BAG3(Eg-BAG3)和EB1(Eg-EB1)的分子特征及在原头蚴细胞凋亡过程中的作用,采用原核表达方法获得重组Eg-BAG3和Eg-EB1,利用生物信息学、蛋白免疫印迹及免疫荧光定位方法对Eg-BAG3和Eg-EB1的分子特征进行了初步探究,随后利用10 mmol·L^-1H₂O₂诱导原头蚴细胞凋亡,qRT-PCR方法检测Eg-BAG3和Eg-EB1的转录水平,并通过RNA干扰技术进一步探究二者与原头蚴细胞凋亡之间的关系。结果显示,Eg-BAG3含有BAG蛋白家族特征性的BAG结构域,Eg-EB1含有内吞蛋白家族特征性的BAR结构域,二者分别属于典型的BAG蛋白和内吞蛋白。免疫荧光定位结果显示Eg-BAG3广泛分布于细粒棘球绦虫的各个发育时期,Eg-EB1主要定位于原头蚴皮层、吸盘及顶突和包囊生发层,而在成虫未见特异性分布。H₂O₂可以成功诱导原头蚴细胞凋亡,且原头蚴中Eg-BAG3和Eg-EB1的相对转录水平都随着H₂O₂处理时间的延长而显著上升,在8 h后的相对转录水平与0 h相比具有显著性差异(P<0.05)。RNA干扰结果显示,Eg-BAG3干扰组原头蚴细胞凋亡率显著高于未干扰组(P<0.05),而Eg-EB1干扰组原头蚴细胞凋亡率低于未干扰组(P<0.05),表明Eg-BAG3在H₂O₂诱导的原头蚴细胞凋亡过程中起到抗凋亡作用,而Eg-EB1起到促凋亡作用。Eg-BAG3可以抑制氧化应激诱导的原头蚴细胞凋亡而Eg-EB1促进细胞凋亡,且二者可能参与调控不育囊的形成。     

犬细粒棘球绦虫的驱虫试验

为了进一步做好包虫病防控工作,开展了犬细粒棘球虫驱虫试验,以观察吡喹酮片对犬细粒棘球绦虫的驱除效果。选择当地土种犬作为试验犬,分为试验组和对照组,按5 mg/kg剂量分别直接投喂试验药品和对照药品,连续进行三次投药,试验投药前后对犬粪便分别采取犬细粒棘球绦虫抗原检测;同时在犬投药前后,分别采取羊粪便进行细粒棘球绦虫抗原检测。试验组和对照组的驱虫效果均为100%,但对照组犬的主动吞食率较低为0.38%,而试验组犬主动吞食率达到89.22%;在犬驱虫试验区域,羊只的细粒棘球绦虫感染率也大幅度下降,其中试验组感染率下降到了10%;对照组下降到23.33%。试验药品中加入天然成分掩盖吡喹酮的苦味,使犬的主动吞食率增高,且该药品相对松软有助于分割使用。因此该试验药品是比较理想的抗寄生虫药物,用于驱除犬细粒棘球绦虫效果较好,推荐剂量为5 mg/kg。