非编码小RNA对大肠杆菌致病性的调控研究进展

细菌在不同生境中增殖并适应不断变化环境的能力依赖于基因的快速表达和严格调节。在自然环境中,细菌经常遭遇温度、营养、酸碱度、铁离子浓度等条件的改变,为其生存和增殖带来巨大挑战和压力。为适应环境,细菌自身进化出一系列机制感应环境变化,并通过调整基因表达和蛋白活性来适应这些变化[1]。细菌sRNA是一类在基因组中可被转录但不被翻译成蛋白质的RNA分子。与蛋白质调控系统不同,当细菌遭遇不同环境胁迫时,sRNA可与DNA结合,抑制基因转录;或识别并结合靶标mRNA后将其降解,抑制mRNA翻译;或直接与相应蛋白结合,影响蛋白质活性,快速应答环境变化。     

Fur/RyhB调控禽致病性大肠杆菌运动性机制的研究

大肠杆菌的运动性主要由鞭毛提供动力,鞭毛是致病性大肠杆菌重要毒力因子之一,本文通过探究Fur及其负调控的非编码RNA——RyhB对禽致病性大肠杆菌（APEC）运动性的影响,为探索防控禽大肠杆菌病的潜在靶点提供科学依据。通过Red同源重组方法构建AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,比较缺失株与原始株运动性特征,结合转录组学数据探究Fur和RyhB对APEC鞭毛以及生物被膜形成的影响。结果显示成功构建了AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,转录组学结果显示Fur的缺失基本上使所有鞭毛相关的基因下调。Fur的缺失使APEC的运动性显著减弱,RyhB对APEC的运动性没有显著影响,△Fur/RyhB较△Fur运动能力有所增加。△Fur和△Fur/RyhB生物被膜形成能力显著增强,△RyhB生物被膜形成减弱,与运动性趋势基本一致。Fur对禽致病性大肠杆菌的鞭毛组装有非常重要的作用,其负调控的RyhB一定程度上可以抑制这种作用机制的影响,并进一步影响了生物被膜的形成,为寻找相关药物靶点提供可能。     

Fur/RyhB调控禽致病性大肠杆菌运动性机制的研究

大肠杆菌的运动性主要由鞭毛提供动力,鞭毛是致病性大肠杆菌重要毒力因子之一,本文通过探究Fur及其负调控的非编码RNA——RyhB对禽致病性大肠杆菌(APEC)运动性的影响,为探索防控禽大肠杆菌病的潜在靶点提供科学依据。通过Red同源重组方法构建AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,比较缺失株与原始株运动性特征,结合转录组学数据探究Fur和RyhB对APEC鞭毛以及生物被膜形成的影响。结果显示成功构建了AE17△Fur和AE17△Fur/RyhB,转录组学结果显示Fur的缺失基本上使所有鞭毛相关的基因下调。Fur的缺失使APEC的运动性显著减弱,RyhB对APEC的运动性没有显著影响,△Fur/RyhB较△Fur运动能力有所增加。△Fur和△Fur/RyhB生物被膜形成能力显著增强,△RyhB生物被膜形成减弱,与运动性趋势基本一致。Fur对禽致病性大肠杆菌的鞭毛组装有非常重要的作用,其负调控的RyhB一定程度上可以抑制这种作用机制的影响,并进一步影响了生物被膜的形成,为寻找相关药物靶点提供可能。     

沙门菌非编码小RNA RyhB研究进展

非编码小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是一类基因组中被转录但不翻译成蛋白质的RNA分子,可在转录后水平调控基因表达。与蛋白质介导的调控系统不同,当细菌遇到不利的生长环境时,sRNA介导的调控可对环境变化做出快速应答。沙门菌RyhB-1和RyhB-2是两种相似性较高的sRNA,通过碱基互补配对方式,在调控因子作用下共同或单独调控靶基因表达。铁匮乏时,RyhB-1和RyhB-2可促进沙门菌摄取铁元素、限制胞内非必需含铁蛋白生成以及加快铁硫蛋白的储存,是沙门菌在转录后水平调控铁稳态的主要元件。此外,当沙门菌遭遇氧化应激、缺氧或酸性环境等不利环境胁迫时,RyhB可分别控制活性氧自由基的生成、平衡硝酸盐等无机物稳态、调节细菌运动性以及沙门菌毒力等应对环境变化。本文就沙门菌RyhB生理特征及其调控机制和功能进行阐述,以期为后续沙门菌RyhB的研究提供指导信息。     

基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力

为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。     

肠炎沙门菌非编码小RNA RyhB调控SopE蛋白的表达研究

为研究肠炎沙门菌(SE)50336非编码小RNA(RyhB-1、RyhB-2)对毒力蛋白SopE的调控作用,利用pET原核表达系统表达SE50336 SopE蛋白,免疫BALB/c小鼠获得SopE蛋白的特异性多克隆抗体(多抗)并分析制备血清的特异性。通过Western-blot检测野生株SE50336、RyhB单缺失株(SE50336 ΔryhB-1、SE50336 ΔryhB-2),以及RyhB双缺失株(SE50336 ΔryhB-1ΔryhB-2)中SopE蛋白的表达水平,分析RyhB对SopE的调控作用。结果显示:成功构建重组质粒pET28a-sopE,转化BL21(DE3)感受态细胞后,在IPTG 0.3 mmol/L、温度37℃、转速220 r/min、诱导时间4 h的条件下,SopE蛋白在包涵体中表达;Western-blot结果显示制备的多抗可特异性检测肠炎沙门菌SopE蛋白;与野生株相比,RyhB单缺失株SopE蛋白表达量下降,双缺失株下降更明显,表明RyhB-1和RyhB-2均可上调SopE蛋白的表达。以上结果为进一步研究RyhB-1和RyhB-2对SopE的调控作用机制奠定基础。     

禽源致病性大肠杆菌的耐药性和毒力基因研究

为了解广东省佛山市禽源致病性大肠杆菌抗生素敏感性及其毒力因子携带情况,采集疑似禽大肠杆菌患病禽的肝脏和肺脏病料,用于禽源致病性大肠杆菌的分离培养、形态学观察、生化鉴定,并运用药敏片检测菌株对13种抗菌药的体外敏感性,采用PCR方法调查了9种毒力因子携带情况。结果显示:108株分离株的生化特性基本一致;所有菌株均具有5种以上的药物耐受性,95%以上对阿莫西林、氯霉素和头孢氨苄耐受,56.48%以上菌株对所检测的12种抗菌药耐受;分离株pap C和vat基因的检出率最低分别为2.78%和5.56%,分布率最高的基因为iuc D(74.07%)、iss(62.96%)、tsh(56.48%)和hly F(55.56%);耐药性和毒力之间的分析结果表明,25%的菌株是含有5种以上毒力基因的强毒株,强毒株中66.67%的菌株对12种抗菌药耐受。     

不同禽源致病性大肠杆菌毒力基因分布规律研究

禽致病性大肠杆菌的毒力因子在其致病过程中发挥了重要作用,目前研究较多的毒力因子包括:菌毛、非菌毛黏附素、耶尔森菌强毒力岛(HPI)、溶血素、抗血清存活因子、毒素、侵袭素等。为了解不同毒力基因在菌株间分布规律,选定7个主要毒力因子的编码基因:fimC(Ⅰ型菌毛)、kpsM(荚膜多糖)、cvaC(大肠杆菌素)、sodA(超氧化物歧化酶)、csgA(curli菌毛)、tsh(温度敏感性血凝素)和marA(多重耐药调控基因),通过对本实验室保存的34株不同禽源的禽致病性大肠杆菌进行毒力基因的检测,结果发现,fimC(94.1%)、cvaC(82.4%)、sodA(97.1%)、csgA(97.1%)、tsh(76.5%)和marA(100%)这6个毒力基因的分布率均较高,但相互之间也存在差异。kpsM基因的分布率较低,只有0.09%,并且仅在鸡源性禽致病性大肠杆菌中检测到。     

非编码小RNA InvR对肠炎沙门氏菌致病性调控的研究

为研究肠炎沙门氏菌非编码小RNA InvR对肠炎沙门氏菌致病性的作用,本研究克隆了肠炎沙门氏菌50336菌株invR基因,通过λ-Red同源重组系统构建了invR缺失突变株,并利用表达载体pBR322构建了回补株.采用比浊法测定了50336野生株,invR缺失株和回补株的生长曲线,结果显示invR的缺失不影响细菌的生长...     

肠炎沙门氏菌非编码小RNA STnc640对菌毛相关基因的调控分析

STnc640是一种功能未知的沙门氏菌非编码小RNA(sRNA),为研究其对肠炎沙门氏菌(SE)菌毛相关基因的调控作用,本研究通过λ噬菌体Red同源重组系统构建了SE50336株stnc640缺失突变株(50336△stnc640),并利用表达载体p BR322构建了回补株50336△stnc640/pstnc640。利用荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)检测STnc640在SE50336株不同生长时期的转录水平,结果显示,细菌生长的稳定后期STnc640转录水平最高,为对数生长早期表达量的16.5倍;同时检测主要菌毛亚单位sefA、safA、stbA、sthA、csgA、csgD、peg 和外膜蛋白基因ompD的表达,结果显示,相比亲本株50336,50336△stnc640中sef A、csgD和ompD基因的表达均显著下调,而50336△stnc640/pstnc640回补株中以上各基因的表达均得到恢复。本实验结果表明STnc640对SE部分菌毛基因的表达具有调控作用。     

致病性大肠杆菌毒力基因调控的研究进展（一）

本文就致病性大肠杆菌毒力因子协调表达的调控机理和一些对环境条件有反应的毒力相关基因以及球状调控子（持家调节子、毒力调节子、特异调控子）对毒力决策簇表达的调控进行了评述，以期为研究抗感染治疗提供一定的理论基础。     

致病性大肠杆菌毒力基因调控的研究进展（二）

本文接上文继续就致病性大肠杆菌毒力因子协调表达的调控机理和纤毛表达，溶血素表达以及英膜表达的调控进行了综述。     

鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析

自规模化养鸭场患典型大肠杆菌败血症雏鸭分离的282株致病性大肠杆菌（E.coli）中鉴定出210株（包含37种血清型）,其中O93、O78、O92、O76占43.8%（92/210）为优势血清型,O46、O32＆O93混合型、O60＆O93混合型为首次从鸭群中分离到。应用PCR结合核酸序列测定对210株致病性E.coli（鸭大肠杆菌病分离株）和28株自健康雏鸭泄殖腔拭子分离的E.coli（临床健康鸭大肠杆菌分离株）进行包括强毒力岛（HPI）中的鼠疫菌素受体基因（fyuA）和铁调节蛋白基因（irp2）、Ⅰ型菌毛必需蛋白基因（fimC）、P型菌毛结构基因（papA）和血清耐受基因（iss）检测,结果表明：fyuAi、rp2、fimC、papA和iss基因在鸭大肠杆菌病分离株的携带率分别为41.0%、43.3%、92.9%、97.6%和96.7%,在临床健康鸭大肠杆菌分离株的携带率分别为21.4%、25.0%、92.9%、100%和92.9%,患病鸭和临床健康鸭大肠杆菌分离株iss、fimC和papA携带率差异不显著（P〉0.05）,但papA的携带率均显著高于其他宿主（鸡、猪和人）源E.coli;HPI毒力岛在鸭源E.coli中分布较广,其携带率表现为鸭大肠杆菌病分离株极显著高于临床健康鸭大肠杆菌分离株。HPI毒力岛的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关,与O78等特定的血清型有一定的关系。鸭大肠杆菌病分离株有37.6%（79/210）同时携带fyuAi、rp2、fimCi、ss和papA基因,极显著高于健康鸭大肠杆菌分离株的14.3%（4/28）（P〈0.01）。     

phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌的毒力调控作用

phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P0.01)和62.17%(P0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。     

华东部分地区禽致病性大肠杆菌系统进化分群及毒力相关基因的检测

采用PCR方法,对华东地区分离的66株禽致病性大肠杆菌(APEC)进行系统进化分群和9个毒力相关基因的检测。APEC分离株在各系统进化群中均有一定比例的分布,其中A群为33.4%(22/66),B1群为31.8%(21/66),B2群为13.6%(9/66),D群为21.2%(14/66)。毒力基因分布检测结果表明:编码自分泌黏附素的aatA和aatB、侵袭素ibeA、空泡形成毒素基因vat、温度敏感性血凝素tsh、摄铁系统的ybtX、耶尔森毒力岛内的ireA、VI型分泌系统的clpV1和vgrG等基因的分布率分别为59.1%、13.6%,7.58%、37.9%、36.4%、25.8%、6.06%、21.2%和42.4%,其中aatA、tsh、vat、ybtX、ireA、clpV1 6个基因在各进化群中分布较为广泛,而个别基因如ibeA仅在B2群中检出,在其他进化群没用检出。本研究有助于进一步了解禽大肠杆菌病的分子流行病学特点,并为该病的防控提供了基础。     

禽致病性大肠杆菌phoP/phoQ基因敲除株的构建及其毒力基因转录调控的研究

为研究Pho P/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病性的调控作用,本研究采用Red同源重组技术分别构建了APEC AE17株的pho P基因敲除株AE18和pho Q基因敲除株AE19,并通过p STV-28质粒分别构建pho P和pho Q基因回补株CAE18和CAE19。并对这些菌株的运动能力、对鸡胚成纤维细胞(CEF)的黏附和侵入能力以及其13个毒力基因的转录水平进行了检测。结果表明,pho P和pho Q基因敲除株运动性能力分别为AE17的70.92%和83.83%;黏附和侵入CEF细胞的能力比AE17均极显著降低,分别为AE17的63.11%、65.42%和59.83%、57.82%。荧光定量PCR结果显示,AE18的毒力基因(sod A、pol A和iss)和AE19的毒力基因(fim C和iss)比AE17相应的毒力基因m RNA的转录水平均呈极显著下降(p0.01)。此外,回补株CAE18和CAE19株能够部分恢复运动性能力、黏附和侵入CEF细胞的能力及相关毒力基因的转录水平。结果表明pho P和pho Q基因的敲除均能够显著改变APEC AE17株相关的生物学特性,并且能够调控毒力基因的转录水平,使其毒力显著下降。本研究为进一步了解APEC的Pho P/Q二元调控系统对其致病性影响提供实验依据。     

红嘴鸥源致病性大肠杆菌毒力基因检测及致病性分析

以10株红嘴鸥源大肠杆菌云南省分离株为研究对象,采用PCR菌株进行毒力基因测定并进行小鼠致病性试验。PCR性率依次为astA(60%6株)、fuyA(60%6株)、Iss(50%5株)、iucD(50%5株)、tsh(40%4株)、Vat(30%3株)、papC(30%3株)、kpsⅡ(30%3株)、hlyE(20%2株)、irp2(20%2株)、fimH(10%1株),小鼠致病性试验结果显示携带毒力基因数量多的菌株致病力越强,小鼠发病时间死亡时间越短。结果说明:10株分离菌株均携带不同的毒力基因,不同毒力基因的组合与小鼠的致病力密切相关。不同毒力基因的组合对小鼠相关致病机理有一定关系,有待进一步研究。     

禽优势血清型大肠杆菌部分相关毒力基因的检测

为研究禽大肠杆菌的致病性及相关生物特性,试验对湖北省各地方养殖场送检的病料,通过分离培养及生化鉴定,分离得到232株禽大肠杆菌。18个O因子血清鉴定结果显示,优势血清型为O_(20)(19)、O_(78)(27),这两种血清型菌株合计46株,占血清型定型菌株的25.99%(未定型菌株为55株)。对优势血清型禽大肠杆菌菌株进行毒力基因检测,结果表明fimH、iroD、iucD、estA和ibeA基因携带率分别为87.88%、57.58%、48.49%、36.37%、0%。研究结果为湖北地区大肠杆菌防控和疫苗的研制提供数据支撑,并为阐明大肠杆菌的致病机理奠定基础。     

肠炎沙门菌非编码小RNA isrC基因缺失株的致病性

细菌非编码小RNA(sRNA)是一类可在转录后水平调控基因表达的调节子。IsrC是存在于鼠伤寒沙门菌毒力岛上的一种与毒力相关的sRNA,可调节巨噬细胞存活蛋白MsgA的表达。本研究克隆了肠炎沙门菌50336菌株isrC基因,通过λ-Red同源重组系统构建了isrC缺失突变株50336△isrC,并利用表达载体pBR322构建了回补株50336△isrC/pisrC。将野生株,isrC突变株和回补株分别接种1日龄清远麻鸡,比较三者之间的致病性差异。结果显示,肠炎沙门菌isrC基因与鼠伤寒沙门菌同源性为100%;成功构建了isrC缺失突变株和回补株;野生株,突变株和回补株对雏鸡的半数致死量(LD50)分别为2.81×108 CFU,2.02×108 CFU和3.10×108 CFU,相比野生株50336,突变株50336△isrC的LD50明显下降,表明isrC基因的缺失增强了肠炎沙门菌的毒力。     

禽致病性大肠杆菌IMT5155株毒力相关基因片段E9的表达及生物学特性分析

根据禽致病性大肠杆菌IMT5155毒力相关基因E9的序列,设计并合成了1对特异性引物,以IMT5155菌株的基因组DNA为模板扩增了E9基因所在ORF的部分序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a(+)载体中,构建了原核表达质粒pET-28a-E9,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(32.2 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有免疫反应性。对重组蛋白进行纯化后免疫动物进行抗体效价测定,进一步分析重组蛋白的相关生物学功能,分别进行了细胞毒性试验、动物试验、细胞黏附与黏附影响试验。结果表明,该蛋白没有细胞毒性,对小鼠亦无毒性,有一定的黏附作用。