5-Azadc和TSA对鸡Nanog基因启动活性及ESC多能性维持的影响

旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据。PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对Nanog基因启动子活性的影响。选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5-Azadc+TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高Nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4(Tβ4)基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155～-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降(P0.05)。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

鸡Dazl基因启动子活性检测及其诱导剂的初步筛选

论文旨在确定Dazl基因核心启动子活性调控区,并比较不同诱导剂的诱导效率,筛选出最佳基因诱导剂。用PCR技术扩增不同长度的Dazl基因启动子,插入到pEGFP-N1和/或pGL3-basic载体中,构建重组载体;再将这些重组载体分别转染DF-1细胞系和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Dazl基因启动子核心活性区域;添加单因素或多因素诱导因子,比较不同诱导剂以及诱导剂组合对鸡Dazl基因启动子活性的影响大小。如皋黄鸡Dazl基因的-932bp~-186bp区域在DF-1和GC-1两种细胞中,都有不同程度的启动活性,而-186bp~-39bp启动子活性几乎完全丧失;诱导剂筛选结果表明,FSH+E2组和Am80组、E2组能够显著提高Dazl基因启动子的活性,RA组、ATRA组、FSH组和睾酮组都不同程度地提高了启动子的活性,而睾丸提取液和BMP4对启动子活性没有显著影响。通过体外诱导实验筛选出如皋黄鸡Dazl基因最适诱导剂,为鸡ESCs体外向雄性生殖细胞分化的细胞诱导剂进一步筛选奠定了基础。     

徐淮山羊c-Myc基因启动子的克隆及其功能的初步分析

本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402~-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334~+1bp区域的启动子活性最强,-402~+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334~-971bp、-587~-147bp区域存在正调控元件,-1 976~-1 334bp、-971~-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

水貂DCT基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了找到水貂多巴色素异构酶(DCT)基因启动子活性区域及转录因子结合位点,试验采用PCR扩增与克隆,构建双荧光素酶报告基因重组质粒,分别转染到293T细胞和A375细胞,测定其活性,并利用在线软件对序列进行生物信息学分析,预测水貂DCT基因核心启动子区域的转录因子结合位点。结果表明:得到的6个不同长度的启动子片段均具有明显的启动子活性,且-1 292～+113 bp区域活性最高,提示其为水貂DCT基因核心启动子区域;成功筛选出337 bp水貂DCT基因活性较高的启动子片段,发现转录因子特异性蛋白1(Sp1)可能是调控启动子活性的重要转录因子。     

绵羊miR-150启动子的鉴定及生殖激素对其转录调控研究

旨在对绵羊miR-150基因的启动子进行鉴定以及探索生殖激素对miR-150启动子转录调控的影响。本研究利用生物学软件预测雌性绵羊(小尾寒羊)卵巢miR-150启动子区域及繁殖相关转录因子结合位点,构建重组质粒,并利用双荧光素酶报告基因检测miR-150的启动子活性。通过在无血清培养基内添加FSH、LH和E_2,进行miR-150启动子重组质粒转染并检测miR-150启动子活性。结果,分别利用Promoter 2.0和PROMO软件预测出miR-150启动子区域和转录起始位点,并获得了与繁殖相关转录因子结合位点。所预测的绵羊miR-150启动子片段序列长度为582 bp,且成功构建miR-150启动子质粒,并确定绵羊颗粒细胞的最佳转染效率(脂质体∶质粒DNA=1∶1)和质粒最佳转染比例(50∶1),从而验证了所预测的区域具有启动子活性。此外,FSH、LH和E_2处理组与对照组(无激素组)相比,miR-150启动子的活性均显著下调(P0.05)。结果表明,生殖激素可以通过影响绵羊miR-150启动子活性来调控miR-150基因的表达,为miR-150调控卵泡发育的机制研究提供了新思路。     

牛骨骼肌α-actin基因5′上游调控元件及内含子功能的初步分析

采用PCR定点突变分析法确定牛骨骼肌α-actin启动子-361~-462bp区域的调控元件Sp1/KLFs、ZF5F和Pax3结合位点的功能;利用基因重组技术,将内含子Ⅰ和内含子Ⅱ分别连在启动子缺失片段的上游和下游,构建双荧光素酶表达载体,使其转染牛骨骼肌卫星细胞和胎儿成纤维细胞,进行活性检测。结果显示,Sp1/KLFs降低牛骨骼肌α-actin基因启动子活性,ZF5F和Pax3均能增强启动子活性。内含子在启动子上游增强了启动子活性,在其下游降低了启动子活性,且顺式调控元件和内含子均具有肌肉特异性。结果表明,初步确定了参与牛骨骼肌α-actin基因转录调控的负顺式调控元件Sp1/KLFs,正顺式调控元件ZF5F和Pax3,发现了内含子插入启动子的位置很重要,为以后构建牛骨骼肌α-actin高活性的启动子奠定了基础。     

鸡Stra8基因真核表达载体构建及亚细胞定位的研究

试验旨在克隆苏禽黄鸡视黄酸激活基因8(Stra8)的cDNA序列,构建pEGFP-C1-Stra8载体并制备鸡Stra8抗体.通过RT-PCR克隆苏禽黄鸡Stra8基因cDNA,构建pEGFP-C1-Stra8和pcDNA3.1(+)-Stra8重组质粒,分别转染NIH-3T3细胞和免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光法检测抗体效价以及在细胞中的分布.结果显示,苏禽黄鸡Stra8基因cDNA全长645 bp,共编码214个氨基酸,提交至GenBank获得登录号为JX204292.1；成功制备Stra8多克隆抗体,pEGFP-C1-Stra8融合蛋白在NIH-3T3细胞质中表达.该结果为深入探讨禽类Stra8生物学功能奠定了基础.     

水貂TYRP1基因启动子活性和Sp1结合位点

以同源性较高的雪貂TYRP1基因序列(GenBank:NW_004569257.1)为模板,通过PCR扩增7个不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-Basic载体中,利用脂质体转染到A375和293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测活性,利用多个在线软件分别分析启动子区活性及转录因子结合位点,并构建突变体进行活性验证。结果显示:成功构建7个不同长度的启动子缺失片段重组质粒,其中6个片段具有明显的启动子活性。-367/+70区域为水貂TYRP1基因核心启动子区域,-367/-144区域的缺失,启动子活性无明显变化,-144/-37区域的缺失使启动子活性明显下降,表明该区域可能存在正调控元件。通过生物信息学方法预测可能存在Sp1转录因子结合位点,构建的Mut-Sp1-2突变体活性明显低于野生型pGL3-215,差异极显著(P0.01)。结果表明:成功筛选了水貂TYRP1基因核心启动子区域(-367/+70),确定Sp1(-56/-45)结合位点为转录的正调控区域。     

家蚕CIb1基因启动子活性分析

用PCR方法从家蚕基因组DNA扩增了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂b1基因(CIb1)4个不同长度的启动子片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染家蚕BmN细胞,体外分析了该基因启动子的活性。结果表明,家蚕CIb1基因启动子在BmN细胞中有微弱的转录活性;野生型BmNPV感染能增强启动子活性;hr3增强的不同长度CIb1基因启动子片段的活性有显著差异,提示转录起始位点上游-74～-1nt包含了启动子的基本元件,而在-687～-465nt、-465～-317nt和-317～-74nt存在着主要的顺式元件。试验结果有助于阐明CIb1的表达调控机理和对家蚕天然性免疫的理解。     

调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析

ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。     

鸡IFN-β启动子荧光素酶报告载体的构建与活性检测

构建并鉴定鸡β干扰素(IFN-β)基因启动子荧光素酶报告基因载体并进行转录活性分析.通过PCR方法从鸡基因组DNA中克隆鸡IFN-β基因启动子,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-basic载体上,构建鸡IFN-β基因启动子荧光素酶报告基因载体pChIFN-β-luc;用脂质体法将构建的报告基因载体瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,并设置空白对照组和poly(I:C)处理组,检测荧光素酶的活性.经PCR扩增出鸡IFN-β基因启动子序列,双酶切及测序鉴定各重组体构建正确;转染后检测,pChIFN-β-luc具有转录活性,并且在poly(I:C)的刺激下其荧光素酶活性显著升高.本试验为进一步研究鸡IFN-β基因转录调控机制奠定了基础.     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca²⁺依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。     

猪Nhlh2基因启动子活性及其表达调控的初步研究

旨在研究母猪Nhlh2基因启动子活性及其与转录因子之间的调控关系,为探索该基因的表达调控提供分子水平的依据,也为研究母猪繁殖机制提供一定的参考。本研究以猪卵巢组织DNA为模板,PCR扩增Nhlh2不同长度的启动子缺失片段,克隆到pGL3-basic载体构建启动子报告基因重组质粒,并将其转染到猪卵巢颗粒细胞,测定相对双荧光素酶活性值;通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP),研究Nhlh2启动子与YY1、C/EBPβ蛋白之间的相互作用;随后构建转录因子超表达、突变载体和小干扰RNA(siRNA),利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。经双荧光素酶报告系统检测发现,Nhlh2基因的P7(-238~+129)区域启动子转录活性最高,-654~-238片段范围可能存在负调控元件,-238~-20区域可能存在正调控元件;通过生物信息学分析和ChIP验证,Nhlh2启动子区-101~-85和-153~-140区域分别是转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点;突变YY1和C/EBPβ的结合位点后,P7的双荧光活性显著上调;超表达YY1和C/EBPβ后,P7的双荧光活性显著下调;干扰YY1和C/EBPβ的表达后,P7的双荧光活性显著上调。本研究确定了猪Nhlh2基因的核心启动子区域为-238~+129,YY1和C/EBPβ分别结合在Nhlh2基因启动子区的-101~-85和-153~-140区域,抑制猪Nhlh2基因的转录活性。     

鸡CAST基因5′侧翼区G-198A突变对启动子转录活性的影响

钙蛋白酶抑制蛋白在宰后嫩度和肌原纤维更新过程中起着关键的作用。为探讨CAST基因启动区G-198A突变位点不同基因型启动子活性,构建鸡CAST基因5′调控区CAST517序列的不同基因型双荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-CAST517/promoter),采用脂质体转染法将不同基因型报告基因表达载体质粒(pGL3-CAST517G/promoter和pGL3-CAST517A/promoter)、空白对照质粒(pGL3-Basic)和海肾荧光素酶载体质粒pRL-CMV共转染至293T细胞,利用t检验法分析不同基因型的启动子活性,在线工具对CAST517序列结合位点和转录因子进行预测,分析转录水平。结果显示,CAST517A作为启动子时,萤火虫对海肾荧光素酶的强度比值要比使用CAST517G启动子效率提高113.89%,呈高效表达(P0.01);在线预测结果显示,CAST517序列存在1个类似TATA盒、1个转录起点、3个潜在的顺式调控原件(PR、ER和GATA-1)和1个潜在的反式调控原件(TGGCA-binding)。携带CAST517A的个体具有较高的转录水平,说明该基因可能对鸡肉质性状有一定的调控作用,研究结果为CAST基因的表达和功能及优质肉鸡的选育提供了可靠依据。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。